近二十年来,生物、化学、医学、物理学、材料学等多学科交叉,为分析方法的变革创造了良好的机遇,带来了全新的生物分析模式。细胞,尤其是肿瘤细胞,一直是研究的热点。而作为与肿瘤细胞密切相关的功能分子,如细胞表面聚糖和细胞内端粒酶(telomerase)等,也引起了持续的关注。首先,聚糖由于其结构的复杂性,缺乏有效而灵敏的检测方法,其次,端粒酶活性的检测方法大多局限在细胞裂解液中使用,缺乏能原位检测细胞内端粒酶活性的技术。因此本论文结合复合纳米材料和电化学、光学等技术,发展了多种原位检测细胞表面唾液酸(sialic acid,缩写为SA)的新方法,构建了多种响应性的纳米探针,提出了原位检测细胞内端粒酶活性的新策略。细胞功能分子的多种原位检测方法的建立,为肿瘤的诊断、治疗、肿瘤药物的筛查以及肿瘤相关的医学研究提供了有力的工具。本文主要包括以下五个部分：1、双功能化纳米角探针与细胞表面唾液酸化学选择性识别的电化学检测将3-氨基苯硼酸(APBA)与亲和素同时修饰到单壁碳纳米角(SWNH)上,制备了一种新型的双功能化碳纳米角探针,进一步结合高效化学选择性识别技术,实现了细胞表面唾液酸的原位电化学检测。以BGC-823细胞为模型,利用高碘酸钠(NaIO4),选择性氧化细胞表面唾液酸的C-7位点,生成的醛基用生物素酰肼标记后,可被探针上的亲和素识别。探针与细胞结合后,探针表面的APBA可以进一步捕获甘露糖修饰的金纳米粒子(AuNP),随后加入过量的果糖,通过竞争反应将被捕获的AuNP解离出来,并用电化学方法进行检测。该方法不仅可检测细胞数量,还能分析出单个细胞表面唾液酸聚糖的表达情况。细胞检测的线性范围是5.0×102到1.0×106 cells mL-1,检测限达到380 cells mL-1,单个BGC细胞上SA的平均个数为1.1×108个。该方法灵敏度高,重复性较好,可用于药物作用下细胞表面SA表达水平变化的动态监测。2、荧光关一开可控金纳米探针用于细胞表面唾液酸的原位成像将荧光标记的氨基苯硼酸(DAPB)修饰到聚唾液酸(PSA)包裹的金纳米粒子(AuNP).上,制备了一种新型的荧光关-开可控的金纳米探针,可对细胞表面的唾液酸进行原位成像检测。以HeLa细胞为模型,将金纳米探针与细胞温育,通过细胞表面的唾液酸与探针上的PSA竞争,将DAPB从探针转移到细胞表面SA,使得DAPB离开金纳米粒子而产生荧光,细胞表面唾液酸被“点亮”。该探针可用于检测细胞数量和对细胞表面唾液酸的分布情况进行原位成像和定量检测。计算得到单个HeLa细胞上SA的平均个数为7.0×108个。该探针还可用于动态监测细胞表面唾液酸在药物作用下表达水平的变化,在肿瘤的诊断和治疗方面具有潜在的应用价值。3、端粒酶响应的多孔硅纳米探针用于细胞内端粒酶活性成像提出了一种原位检测细胞内端粒酶活性的方法。以多孔硅纳米粒子(MSN)为载体,在其孔道中共价固定荧光猝灭剂BHQ、填充荧光素,并通过静电吸附在其表面包裹含端粒酶引物序列(TSP)的DNA链01,将荧光素封堵在孔道中。BHQ的存在猝灭了荧光素的荧光,纳米探针的荧光状态为“关”。在端粒酶的作用下,探针表面01的3’端被延长,生成多个与5’端互补的TTAGGG片段,导致两端杂交形成环状结构而脱离探针表面,从而打开孔道,释放出探针中的荧光素,使荧光状态转换为“开”。将探针与细胞温育,探针进入细胞质后,在细胞质中端粒酶作用下打开探针孔道,利用释放的荧光素产生的荧光,实现了细胞内端粒酶活性的原位检测。计算得到单个不同细胞内端粒酶的平均活性分别为：HeLa细胞,3.0×10-11 IU; BEL细胞,2.0×10-11 IU; QSG细胞,8.0×10-13。本方法能原位检测细胞内端粒酶活性,区分正常和肿瘤细胞,还能动态监测细胞内端粒酶表达水平在药物作用下的变化,在生物医学和临床研究中具有良好的应用前景。4、端粒酶响应性智能试剂盒用于原位监测细胞内端粒酶活性设计了一个可原位成像检测细胞内端粒酶活性的智能试剂盒。该囊泡试剂盒利用脂质体包裹端粒酶引物(TSP)序列以及末端标记有荧光分子Cy5的分子信标(MB)功能化的金纳米探针。囊泡试剂盒被转运到细胞质中,然后释放出囊泡内的物质。在细胞内端粒酶的作用下,TSP的3’端被延长,生成的端粒重复序列恰好与探针表面的MB的环状部分互补杂交,导致MB被打开,荧光状态从“关”转变为“开”。荧光信号的强度与端粒酶活性相关,由此提出了一种原位成像和定量检测端粒酶活性的新方法。本方法测得单个不同细胞内端粒酶的平均活性分别为：HeLa细胞,3.2×10-11IU;BEL细胞,2.4×10-11 IU;QSG细胞,8.6×10-13IU。因此该试剂盒可以用于区分肿瘤和正常细胞,还可用于动态监测细胞内端粒酶活性在端粒酶药物作用下的变化,为发现和筛选端粒酶靶向的抗癌药物提供了有潜力的工具。5、一种缺口分子信标及其功能化金纳米探针用于细胞内端粒酶活性的原位检测设计了一种带缺口的分子信标功能化的探针,用于原位成像检测细胞内端粒酶活性。该探针以AuNP为载体,MB为茎-环结构,并带有一个缺口,将整个DNA序列分为两段：较短的一段是端粒酶引物序列TSP；较长的一段(1-MB)含环状结构,其茎部3’端的巯基可共价连接AuNP,5’端修饰荧光分子Cy5。由于荧光共振能量转移,Cy5的荧光被AuNP猝灭,纳米探针的荧光状态为“关”。将探针与细胞温育,探针进入细胞后,在细胞质内端粒酶的作用下,TSP被延长并发生内部链取代,打开1-MB环,导致Cy5远离AuNP表面,将荧光状态转换为“开”。该探针通过“一步温育”即可实现对活细胞内端粒酶活性进行监测和定量,测得单个不同细胞内端粒酶的平均活性分别为：HeLa细胞,3.1×10-11 IU;MCF细胞,1.4×10-11 IU;BGC细胞,2.5×10-11 IU;BEL细胞,2.1×10-11 IU;QSG细胞,8.4×10-13 IU。该方法可区分肿瘤和正常细胞,还可用于监测细胞内端粒酶活性在端粒酶抑制药物作用下的降低,证明该方法在临床诊断和治疗方面具有良好的应用前景。