蛋氨酸具有的多种生理功能,在食品、医药及饲料行业中具有较高商业价值。因其代谢调控复杂,一直不能发酵法生产,致使氨基酸生产企业和科研人员不断投入精力进行蛋氨酸菌种选育。菌种选育的研究思路基本包含两方面:一方面调控酶的基因表达量,通过启动子工程、动态调控等方法提高或降低基因表达量;另一方面改造酶的催化性质,由于蛋氨酸生物合成途径中多个关键酶受到严格的反馈调控,对酶的改造同样十分重要。本实验以谷氨酸棒杆菌为出发菌种,首先过表达天冬氨酸激酶(Aspartate kinase,AK)和高丝氨酸O-乙酰基转移酶(Homoserine acyltransferase,HAT)提高蛋氨酸合成的碳流量。其中AK是源于北京棒杆菌的单体酶,经本实验室改造解除赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制,酶活为野生型的20-50倍。构建的工程菌经氨基酸产量测定,确定了赖氨酸是主要副产物。为了降低赖氨酸合成途径的碳通量,同时避免敲除该途径导致菌体死亡,选择对赖氨酸合成有重要影响的二氨基庚二酸脱氢酶(Diaminopimelate dehydrogenase,Dap DH)进行体外突变降低酶活,得到的数据为未来弱化赖氨酸途径奠定基础。研究结果如下:1.构建4株过表达AK和HAT的工程菌,提高了蛋氨酸的积累量。以野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌种,分别过表达3个不同酶活AK突变体和AK-HAT共表达突变体,构建出4株重组菌,分别是Cg AK/p EC-NC、Cg AK/p EC-S59F、Cg AK/p EC-T65I和Cg AKM/p EC-T65I-met X并进行发酵测试。从转录结果上看,4株菌中AK和HAT的基因转录水平增大,证明成功电转后基因得到表达。从发酵产物上看,4株菌的蛋氨酸产量分别为2.84 g/L、2.92 g/L、3.04 g/L和3.29 g/L,是原菌的1.55倍、1.59倍1.66倍和1.79倍。发现过表达HAT后可以明显降低苏氨酸产量,但不是降低赖氨酸途径碳流的主要原因,为了更好地降低支路碳流,进一步研究赖氨酸合成途径的关键酶。2.构建了Dap DH野生型表达质粒,通过随机突变PCR和高通量筛选获得13个突变体,分别为D120N、D120R、D120T、G151Q、T169H、T169K、R195G、R195H、H244W、H244M、H244S、N270T和N270S。诱导表达和纯化WT Dap DH和突变体,经SDS-PAGE和Western blot验证Dap DH已在大肠杆菌中高效表达。3.对WT Dap DH和突变体进行酶动力学测定,13个突变体中6株突变体酶活增大,7株突变体酶活降低。D120位点、T169位点和R195位点的突变体酶活均低于Cg Dap DH,G151、H244和N270位点的突变体酶活均比Cg Dap DH增高。其中酶活显著降低的是T169H,是WT Dap DH的11%,Km值为29.91,与底物结合能力变差。此外,D120位点突变株酶活均有所下降,D120N下降最明显,是WT Dap DH的18%。酶活力可能受到关键残基侧链性质和与底物结合能力的影响。4.对WT Dap DH和突变体T169H、D120N进行分子动力学模拟,分析酶活降低原因,为日后的改造提供基础。结果表明T169H位点突变破坏了底物结合口袋的氢键网络,使底物不能稳定与酶结合,且突变后导致底物结合口袋结构的改变疏水微环境被破坏,在两方面共同作用下酶活降低。D120位于底物结合口袋入口,突变前通过侧链与附近螺旋上的残基形成氢键,稳定蛋白构象,同时在蛋白表面形成狭窄空腔,有利于底物以特定形态进入结合口袋。突变后120位点的氢键断裂,增大了底物口袋内溶剂可及面积,破坏疏水环境使酶与底物间相互作用力减少,由此降低酶活。