类风湿关节炎(RA)是一种常见的自身免疫性疾病,以慢性系统性炎症和肢体关节损伤、疼痛为特征。关节滑膜微环境中多种免疫细胞浸润、持续性滑膜炎、成纤维样滑膜细胞(FLS)过度增生是RA特征性的病理表现。树突状细胞(DCs)是功能强大的专业抗原提呈细胞,在炎症免疫反应中发挥重要作用。B细胞活化刺激因子(BAFF)是重要的激活适应性免疫细胞的直接协同刺激因子。RA患者的血清和关节滑液中的BAFF水平显著增加,值得关注的是,在多种自身免疫性疾病中BAFF增加的水平和疾病的活动度密切相关。DCs、单核细胞、巨噬细胞和FLS都可以产生BAFF且表达不同的BAFF受体,提示自分泌和旁分泌产生的BAFF可能通过影响DCs和FLS的功能,参与RA的发生、发展。此外,课题组研究发现BAFF可增加DCs和FLS环氧酶2(COX2)的表达和前列腺素E2(PGE2)的分泌,PGE2-EP4-cAMP信号通路异常可导致滑膜细胞功能紊乱。BAFF体外刺激FLS是否可降低细胞内环磷酸腺苷(cAMP)水平,影响PGE2-cAMP信号,BAFF信号和PGE2信号在FLS中是否相互影响,尚不清楚。新型活性单体药物-苯磺酰芍药苷(芍药苷-6-氧-苯磺酸酯,代号CP-25,专利号ZL201210030616.4)是课题组对白芍中的活性单体芍药苷(Pae)进行酯化修饰后得到的单体化合物,具有较强的抗炎和免疫调节活性。但是CP-25对实验性关节炎是否具有良好的治疗作用,其作用特点和机制如何,仍待研究。本课题在佐剂性关节炎(AA)大鼠模型上观察了CP-25的治疗作用和作用特点,并在以往研究工作基础上进一步以DCs和FLS为研究细胞,运用ELISA、QRT-PCR、流式细胞术、免疫荧光、免疫印迹、激光共聚焦、免疫共沉淀等技术,观察BAFF受体信号对DCs和FLS功能的影响及CP-25的作用,并在FLS中深入研究了BAFF信号和PGE2信号的相互影响及CP-25的作用机制,为探究BAFF及其受体信号参与RA异常炎症免疫反应的病理机制及阐明CP-25的作用靶点提供更多的实验依据。目的：明确BAFF及其受体信号参与AA大鼠异常炎症免疫反应发生发展的病理机制及CP-25的治疗作用。揭示BAFF及其受体信号对DCs和FLS功能影响的分子机制,为阐明CP-25的作用靶点提供依据。方法：1.采用完全弗氏佐剂制备AA大鼠模型,CP-25灌胃给药,足爪仪测量继发侧足爪容积、计算足爪肿胀度,评分多发性关节炎指数,HE染色观察关节、脾脏病理,ELISA法检测BAFF和IL-1p水平,Western blot法和QRT-PCR法检测脾脏组织中BAFF的三个受体BAFF-R、TACI、BCMA表达,免疫组化法检测脾脏DCs的分布和数量,流式细胞术检测AA大鼠脾脏DCs的活化表型CD40,CD80,CD86和MHCII的表达；2.无菌取大鼠骨髓源细胞,经rGM-CSF、rIL-4共刺激诱导生成骨髓源DCs, CCK-8法检测BAFF-DCs与T细胞的混合淋巴细胞反应(MLR), RT-PCR法检测DCs上BAFF-R, TACI、BCMA,以及CP-25对BAFF-DCs和COX2和BAFF的表达,QRT-PCR法检测CP-25对BAFF-DCs IL-1β和TNF-α表达的影响,ELISA法检测BAFF-DCs上清中PGE2水平及CP-25的作用、流式细胞术检测BAFF-DCs表面BAFF的三个受体BAFF-R、TACI、BCMA表达,以及CP-25对BAFF-DCs抗原吞噬功能和表型CD40, CD86和MHCII的表达和细胞凋亡率的影响,Western blot法检测CP-25对BAFF-DCs上TACI、BAFF-R、凋亡相关蛋白及ERK/NF-kB信号通路蛋白表达的影响；3.CCK-8法检测BAFF-DCs对AA大鼠FLS以及BAFF对MH7A的促增殖作用和CP-25的影响,Transwell法检测BAFF-DCs对AA大鼠FLS的迁移和侵袭功能影响及CP-25的作用,QRT-PCR法检测CP-25对BAFF-DCs与AAFLS共培养后FLS中MMP9表达的变化和BAFF对MH7A细胞分泌炎症细胞因子IL-1β, IL-6, TNF-α的影响。Western blot法检测CP-25对BAFF刺激人RA滑膜细胞株MH7A细胞中COX2表达的影响,ELISA检测CP-25对BAFF刺激MH7A细胞上清中PGE2水平和细胞内cAMP水平的影响；4. RT-PCR、流式细胞术以及细胞免疫荧光法检测MH7A细胞中BAFF及其受体的表达,激光共聚焦观察BCMA和TRAF2在MH7A细胞中的共定位情况,Western Blot检测BAFF对MH7A细胞中BCMA、下游连接蛋白TRAF2和NF-kB信号通路蛋白的影响及CP-25的作用,免疫共沉淀法检测BAFF对MH7A细胞TRAF2与GRK2共表达的影响及CP-25的作用,免疫荧光法检测MH7A细胞上EPs受体四种亚型的表达情况,QRT-PCR检测PGE2-EP4信号通路在BAFF对MH7A细胞分泌功能中的影响,超速离心法分离胞浆胞膜蛋白,Western blot检测BAFF对PGE2刺激MH7A细胞膜表达EP4受体和GRK2的影响及CP-25的作用,流式细胞术检测BAFF对EP4激动剂处理不同时间MH7A细胞EP4受体膜表达的变化及CP-25的作用,ELISA检测BAFF对EP4激动剂处理不同时间MH7A细胞内cAMP水平的变化及CP-25的作用,免疫共沉淀法检测BAFF对PGE2刺激MH7A细胞EP4与GRK2共表达的影响及CP-25的作用。结果：1. BAFF及其受体在AA大鼠炎症不同阶段的变化及CP-25的作用在AA大鼠病程研究中发现,血清和脾脏匀浆中的BAFF水平在整个炎症过程中明显增加,且在炎症免疫反应期(d7)最为显著,脾脏匀浆中的BAFF水平与脾脏病变的严重程度有明显的相关性。BAFF的三个受体中TACI和BAFF-R从关节炎早期(d14)起表达明显增加,BCMA在整个炎症过程中变化不明显。而BAFF的主要来源细胞DCs在脾脏中的数量从d7开始明显增加,d14时数量最多；CD40,CD80, CD86和MHCII在脾脏DCs中表型表达也显著升高,并且在d7和d14表型表达最多,BAFF处理的DCs对CD4+T细胞刺激能力明显增强。这些结果提示BAFF及其受体参与了T细胞介导的AA炎症免疫反应的发生和发展,并与DCs功能异常有关。CP-25可明显降低AA大鼠足爪肿胀度和血清中BAFF和IL-1β水平,改善关节病理变化和脾脏病理反应,下调脾脏DCs表面CD40, CD86和MHCII的表达,表明CP-25可在整体水平调节DCs功能,减轻AA大鼠的炎症免疫反应,具有良好的治疗作用。2. BAFF对DCs表型及功能的影响及CP-25的作用BAFF体外刺激可减少DCs的凋亡,上调抗凋亡蛋白Bc12表达,下调促凋亡蛋白Bax表达。同时,BAFF刺激后DCs表面CD40,CD86和MHCII的表达也增加,抗原吞噬摄取能力明显降低；促进DCs中COX2、BAFF、IL-1β和TNF-a表达明显增加,PGE2的分泌也显著增加。DCs主要表达的BAFF受体有TACI和BR3,BAFF刺激后DCs膜上表达TACI和BR3显著增加,p-ERK和p-IkBα、p-P65表达明显增加,提示BAFF-DCs的成熟活化可能主要通过TACI-ERK/NF-kB BR3-ERK/NF-kB信号通路。CP-25可促进BAFF-DCs的凋亡,增加其促凋亡蛋白Bax表达,降低抗凋亡蛋白Bcl2表达;增强BAFF-DCs的吞噬能力,下调CD80, CD86和MHC口的表达；不同程度的抑制BAFF-DCs中COX2、BAFF表达及PGE2、IL-1β、TNF-α等的分泌；降低BAFF-DCs上TACI和BR3表达,抑制下游ERK/NF-kB信号通路的活化。表明CP-25可促进BAFF-DCs凋亡、抑制BAFF-DCs的过度成熟和促炎性细胞因子的分泌,具有抗炎和免疫调节作用。3. BAFF对FLS功能的影响及CP-25的作用BAFF刺激DCs可促进DCs分泌BAFF、PGE2等促炎性细胞因子。BAFF-DCs与AA大鼠FLS共培养可明显促进AA大鼠FLS的增殖、迁移和侵袭,增加AA大鼠FLS中MMP9的表达,提示BAFF和PGE2等炎症介质可能直接参与了AA大鼠关节滑膜的炎症免疫反应。我们发现BAFF体外刺激对人RA滑膜细胞株MH7A无显著促增殖作用,但与PGE2联合共同刺激可增强PGE2的促增殖作用。BAFF体外刺激MH7A 2h后,COX2的表达显著增加,吲哚美辛(INN)可抑制BAFF诱导MH7A细胞产生的炎症介质IL-1β、IL-6、TNF-α的表达,加入PGE2刺激后恢复了BAFF诱导的MH7A细胞对炎症介质的产生。这些结果提示BAFF在FLS的功能异常中发挥了一定的作用,PGE2的存在能够增强BAFF的致炎作用。CP-25可抑制与BAFF-DCs共培养的AA大鼠FLS的增殖、迁移和侵袭,其抑制迁移和侵袭的作用可能与降低了AA大鼠FLS中MMP9的表达有关。CP-25可浓度依赖地抑制BAFF和PGE2联合促MH7A的增殖作用,抑制BAFF诱导的MH7A细胞产生的炎症介质IL-1β、IL-6、TNF-α表达,表明CP-25能够抑制炎症因素刺激下的MH7A异常的增殖和分泌功能。4. BAFF对MH7A细胞相关受体蛋白及相关信号分子表达的影响及CP-25的作用我们发现MH7A细胞上主要表达的BAFF受体是BCMA, BAFF体外刺激不同时间,可不同程度增加COX2、BCMA和其下游的连接蛋白TRAF2的表达,活化下游NF-κB信号通路。BAFF体外刺激24h后可显著降低MH7A细胞内cAMP水平。CP-25 (0.1μM, 1μM, 10μM)均能升高细胞内cAMP水平,提示BAFF刺激会引起PGE2-cAMP信号通路异常,CP-25能够恢复细胞内cAMP水平,调节细胞功能。进一步分析结果我们发现TACI Ig (1μg/ml)较INN (1μM)作用显著,提示BAFF刺激导致的细胞内cAMP降低,可能除了通过促进PGE2分泌之外还存在其他途径。MH7A细胞上主要表达的EPs受体是EP4,给予EP4受体的特异性阻断剂ONO-AE3-208能够显著减少BAFF刺激24h MH7A细胞中TNF-α、IL-1β的表达,EP4受体的特异性激动剂TSC 2510可部分恢复ONO-AE3-208抑制BAFF刺激MH7A细胞表达TNF-a和IL-1p。提示PGE2-EP4可能在BAFF刺激MH7A细胞功能异常中发挥了重要作用。BAFF预处理30min后,EP4受体特异性激动剂TCS 2510分别刺激不同时间点,结果发现在BAFF预处理组较TCS 2510单独刺激,EP4受体的膜表达减少更明显,膜EP4受体在刺激后5-10mmin表达增加,15min开始降低。细胞内cAMP水平检测同样显示,5-10min细胞内cAMP水平增加,15min开始降低。给予BAFF与PGE2联合刺激24h可降低MH7A细胞EP4受体膜表达,增加GRK2的膜表达。进一步通过免疫共沉淀发现BAFF刺激后TRAF2与GRK2的共表达增强,BAFF预处理后PGE2刺激较两者单独刺激时GRK2和EP4的共表达更强。这些结果表明BAFF促进了PGE2刺激的EP4受体过度脱敏,可能与BAFF促进PGE2分泌和BAFF刺激募集TRAF2活化了GRK2进而磷酸化EP4受体有关。CP-25可抑制BAFF刺激后BCMA、TRAF2的表达和下游NF-kB信号通路活化。恢复BAFF与PGE2联合刺激后EP4受体膜表达,降低GRK2的膜表达,减弱BAFF刺激后TRAF2与GRK2的共表达,以及BAFF与PGE2联合刺激后GRK2与EP4的共表达。由此我们推测,CP-25可能通过影响GRK2的活性,调节BAFF对PGE2-EP4-cAMP信号转导平衡的影响,改善滑膜细胞功能紊乱。结论：1.BAFF及其受体介导的DCs功能异常参与了AA大鼠炎症免疫反应的发生发展；2.CP-25整体给药可调节AA大鼠活化的DCs功能,抑制足爪炎症发展,在改善AA大鼠骨质破坏上优于TGP和Pae；3.BAFF通过TACI-ERK/NF-kB和BR3-ERK/NF-kB信号通路影响DCs功能,CP-25可通过调节BAFF-DCs功能,抑制其对AA大鼠FLS的异常活化；4.BAFF信号和PGE2信号的相互作用促进了滑膜细胞功能异常,BAFF促进PGE2刺激MH7A细胞胞膜上EP4受体过度脱敏的机制可能与BAFF促进PGE2分泌和募集TRAF2影响GRK2活化有关；CP-25可能通过改变GRK2活性,调节BAFF对PGE2-EP4-cAMP信号转导平衡的影响,改善滑膜细胞功能紊乱。