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随着科学的发展,多种疾病的产生已被证实与酶及生理过程的异常代谢相关,研发能够特异性调节酶活力及生理过程的药物已经成为当代医学的研究热点,开发新型高效的生物活性酶及生理过程的检测手段是当代分析化学的一项重要任务。由于具有灵敏度高、选择性好、操作简便以及数据重现性好等优点,生物活性酶及生理过程的有机荧光探针的合理设计已经成为探针研究领域的研究热点,寻找新的适用于生物活性酶及生理过程检测的有机荧光探针,仍然极具理论与现实意义。针对上述研究热点,本文在查阅相关文献和技能学习的基础上,结合实验室的现有条件与研究方向,设计并合成一系列用于检测生物活性酶及生理过程的有机小分子荧光探针,并对这些探针的检测性能进行了全面系统的研究,本论文主要有以下几方面的工作:（1）这部分工作设计并合成了一种双光子荧光探针（Q3CA-P）用于人氢醌还原酶（hNQO1）的细胞和组织成像研究。此探针由双光子荧光团Acedan和hNQO1响应基团三甲基琨酸通过酰胺键相连组成,在酰胺键对染料ICT效应的破坏和琨酸结构对染料产生PET效应的双重作用下,淬灭探针的荧光。当NQO1特异性还原琨成酚后,发生分子内成环从而释放出染料Acedan,恢复探针的荧光,从而实现了对hNQO1荧光信号的OFF-ON检测。实验结果表明探针Q3CA-P对hNQO1的响应具有灵敏度高、特异性强和响应速度快等优点,并且成功的对肿瘤细胞和组织内的hNQO1活性进行了成像研究,组织穿透深度可达120μm,该探针为深入研究hNQO1生理功能的提供了一种有效手段工具。（2）借鉴组蛋白去乙酰化酶（HDAC）可以特异性切断末端乙酰胺乙酰基的机理,在这部分工作中我们选择了6-乙酰氨基己酸为响应基团,结合氰基醇可以发生自消除形成醛基化合物,选择醛基双光子萘衍生物（ADAN）为荧光团,设计并合成了用于HDAC的体外检测和细胞成像的双光子荧光探针CDAN。探针CDAN被HDAC特异性切掉末端乙酰基后,由于结构中的邻位氰基增强了氨基进攻羰基的亲核能力,从而发生分子内成环释放出了氰基醇结构,进一步发生氰基醇的消除生成了醛基,恢复探针的荧光,实现对HDAC的检测。通过与对比探针CP的响应能力进行比较,证实了氰基为发生响应的必须结构,为后续相关设计提供了一定的理论指导。体外检测实验结果表明探针CDAN对HDAC的响应具有特异性强,灵敏度高和响应速度快等优点,抑制剂IC50的测定表明探针CDAN可以用于抑制剂的筛选,并且借助此探针成功地对细胞和组织内的HDAC酶活力进行了成像研究,表明该探针对深入研究HDAC的生物学功能上有一定的应用前景。（3）这部分工作中我们以羟基部花菁-氧杂蒽衍生物（Hcy-OH）为近红外荧光团,先对其进行丙烯酰化修饰得到酯化产物Ac-Hcy-OH,接着选择半胱氨酸修饰脯氨酸C端形成的二肽（L-Cys-L-Pro）为脯氨酸氨基肽酶（PAP）的响应基团,通过巯基与丙烯酸酯烯键的加成反应得到PAP近红外探针NIR-PAP。通过液相检测和质谱验证了响应机理为PAP特异性切断末端脯氨酸后,游离出半胱氨酸的氨基,接着发生氨基亲核进攻酯键的羰基形成七元环内酰胺副产物,同时伴随着荧光团的释放,从而实现了荧光信号OFF-ON的检测。体外检测结果表明探针NIR-PAP对PAP的响应具有灵敏度高、特异性强和响应速度快等优点,酶动力学分析证明L-Cys-L-Pro是很好的PAP识别响应底物,并成功的借助此探针通过成像实验和流式细胞检测对多种细胞内的PAP酶活性进行了初步研究,该探针在深入研究PAP的生理学功能上有一定的应用前景。（4）在这部分工作中我们结合生物正交IEDDA反应的优点,设计了线粒体靶向的探针Mito-Tz和溶酶体靶向的探针Lyso-TCO用于对线粒体自噬中的自噬体与溶酶体的融合过程进行成像研究。探针Mito-Tz由于具有阳离子的结构,可以特异性的靶向线粒体,利用四嗪结构对罗丹明荧光的淬灭效应,淬灭探针Mito-Tz的荧光。Lyso-TCO结构中的Bodipy染料具有酸响应能力,使其在细胞内具有优异的溶酶体靶向性,同时结构中的s-TCO可以与Mito-Tz发生IEDDA反应从而激活Mito-Tz的荧光信号。实验结果表明在细胞正常培养的状态下,探针Mito-Tz和Lyso-TCO分别聚集在细胞的线粒体和溶酶体中,验证了探针的细胞器靶向能力。当线粒体发生自噬后,线粒体被自噬体吞噬,最终与溶酶体发生融合,这会让Mito-Tz和Lyso-TCO相遇并发生反应,从而激活Mito-Tz的荧光,实现对线粒体自噬过程中自噬体与溶酶体的融合过程的OFF-ON型荧光信号检测。实验结果表明这两个探针的反应具有响应速度快、抗酸干扰能力强等优点,对HeLa、HepG2和MCF-7细胞的线粒体自噬中自噬体与溶酶体的融合过程都能进行成像检测,证实此种探针的设计理念在对生理过程的成像研究中具有很好的应用前景。