研究背景在肝外伤、肝切除、肝移植以及多器官功能衰竭救治领域中,肝脏缺血再灌注损伤是造成肝功能损害的重要因素,其损伤机理及脏器保护研究始终是肝脏外科、创伤外科,移植外科的重要方向。缺血再灌注损伤是一个受多因素调节和影响的过程。复氧过程中活性氧的产生,Kupffer细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的活化,引起一系列损害性的细胞反应,继而导致炎性反应和细胞凋亡。同时,由于肝窦内皮细胞的损害,产生微循环障碍,进一步加重了肝脏的局部缺血。在缺血再灌注过程中,许多细胞因子和激素的表达水平都发生了改变,并在其中发挥不同的作用,如一氧化氮(NO)、热休克蛋白(HSP)、内皮素(ET)、缺氧诱导因子-Ⅰ(HIF-Ⅰ)、胰岛素样生长因子-Ⅰ等。其中,胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)的作用得到了越来越多的重视。IGF是一类既有胰岛素样合成代谢作用,又有促生长作用的多肽,它们在机体组织细胞的增殖、分化和转化及抑制细胞凋亡中起重要作用,是许多组织生长和分化的重要调节因子,它还对不同的代谢产物、糖和氨基酸转运过程起胰岛素样作用。近年来,IGF-Ⅰ在肝外伤、肝脏手术以及多器官功能衰竭中的异常表达开始引起人们的关注,而关于IGF-Ⅰ与肝脏缺血再灌注损伤的关系,它在肝脏缺血再灌注期表达的时空分布特点及其作用意义,尚未能最后阐明。丹参为我国传统活血祛瘀中药,已有诸多研究表明丹参对重要脏器组织缺血再灌注损伤有较好的保护作用,这一原理主要为两方面,其一是改善微循环灌注不足及抗氧自由基作用,其二是可以降低肝细胞内的游离钙离子浓度,减轻由于钙超载引起的细胞损伤。而丹参的这些对肝脏的保护作用与IGF-Ⅰ是否有一定内在联系,还无人知晓。本课题在以往前期研究工作基础上进一步进行肝缺血再灌注期IGF-Ⅰ表达的研究,整体实验工作分为两部分:第一部分通过建立大鼠肝脏缺血再灌注模型,观察肝缺血再灌注不同时限中IGF-Ⅰ及Caspase-3的表达特点,了解肝脏缺血再灌注IGF-Ⅰ与肝脏功能及细胞凋亡的关系,探讨其时空表达特点及作用意义。第二部分通过对比分析丹参预处理组与未处理组IGF-Ⅰ、Caspase-3表达的不同特点,研究丹参对肝脏缺血再灌注损伤不同时限胰岛素样生长因子-Ⅰ表达的影响及意义。研究工作的目的旨在了解肝脏缺血再灌注期IGF-Ⅰ表达的时空特点及作用意义,以及国药丹参对肝脏缺血再灌注时IGF-Ⅰ表达的影响,从而为肝缺血再灌注损伤的防治探索新的方向。第一章胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)在大鼠肝缺血再灌注不同时限的表达及意义目的建立大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型,观察肝缺血再灌注不同时限中IGF-Ⅰ及Caspase-3的表达特点并了解IGF-Ⅰ在肝缺血再灌注损伤时的时空分布特点及作用意义。方法1.健康纯系SD大鼠75只随机分为3组,正常组(n=25只),假手术组(n=25只)及缺血再灌注组(n=25只),各组内又根据再灌注后不同时间(0h、3h、12h、24h、72h)分为5个亚组,每组5只。2.术前禁食12h,自由饮水。腹腔麻醉生效后,常规备皮、消毒,正常组进腹后直接切取肝组织待测,假手术组仅解剖肝门;缺血再灌注组在肝十二指肠韧带远心端安置无损伤动脉钳钳夹肝蒂45min,于不同复流时间(0h、3h、12h、24h、72h)切取肝组织制备免疫组化及光镜、电镜观察标本,肝上下腔静脉取血测定生化指标。3.IGF—Ⅰ及Caspase-3免疫组化检测依说明书进行。胞浆呈胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性反应。每张切片在400倍光学显微镜下随机选取5个视野,每个视野统计100个细胞中的阳性细胞数。血清ALT和AST采用全自动生化分析仪检测。用光学显微镜和电子显微镜观察肝组织细胞及细胞器病理形态学变化。4.用SPSS13.0进行分析。采用重复测量方差分析,组间比较用单因素方差分析,多重比较用LSD法。P＜0.05认为差异有显著性。结果正常组及假手术组各时限点IGF-Ⅰ表达无显著性差异(P＞0.05)。损伤组再灌注0h时IGF-Ⅰ表达下降,3h下降较明显,其在小叶中央静脉及汇管区的表达明显较肝实质内致密,阳性表达至12h时达到最低点,24h时开始回升。Caspase-3在正常组及假手术组各时限点无显著性差异(P＞0.05),而在损伤组缺血后再灌注0h表达即开始增强,在再灌注24h组表达水平达峰值,至72h后回复到基线水平(P＞0.05)。肝缺血再灌注后外周血清ALT、AST浓度升高,再灌注0h、3h、12h、24h损伤组较同期正常组及假手术组高(P＜0.01),24h时浓度开始下降,至72h时恢复正常。光镜下损伤组再灌注0h时细胞仅轻度水肿,3h肝细胞失去原有正常形态,肝细胞水肿,细胞质降解,核仁缩小、凝集;12h～24h肝细胞进一步水肿,细胞质降解明显,肝血窦严重变窄,肝细胞索排列紊乱。72h肝细胞水肿变轻,可见少量新生肝细胞,肝血窦狭窄程度减轻。电镜下正常对照组及假手术组超微结构形态基本正常,损伤组再灌注3h大部分细胞浓密,细胞间隙增大,细胞肝窦微绒毛致密,核染色质浓缩、边集;12h～24h肝细胞进一步浓密,胞质呈均质状,核膜消失;72h时大部分细胞形态基本正常。小结IGF-Ⅰ可以作为肝脏缺血再灌注时反映肝功能的指标之一;其时空分布特点为:损伤组再灌注0h～24h期间IGF-Ⅰ表达持续下降,以0h～3h下降较明显,12h时达到最低点,24h时开始回升,且在小叶中央静脉及汇管区的表达较肝实质内致密;IGF-Ⅰ作为一种内源性保护因子,可能在一定程度上减轻肝缺血再灌注损伤所造成的肝功能损害。第二章丹参对大鼠肝缺血再灌注不同时限IGF-Ⅰ表达影响的实验研究目的建立大鼠肝脏缺血再灌注损伤未处理组、假手术组、正常组及丹参预处理组,观察丹参预处理组和未处理组IGF-Ⅰ、Caspase-3表达特点,血清酶ALT、AST水平以及肝脏病理形态学变化,探讨丹参在肝脏缺血再灌注不同时限对IGF-Ⅰ表达的影响及意义。方法1.健康纯系SD大鼠100只,随机分4组,正常对照组(n=25只),假手术组(n=25只),未处理组(n=25只),丹参组(n=25只),各组内又根据再灌注后不同时间(0h、3h、12h、24h、72h)分为5小组,每组5只。2.术前禁食12小时,自由饮水。麻醉生效后,常规备皮、消毒,取上腹正中切口长约3cm,正常对照组开腹后直接取材,假手术组开腹后仅解剖肝门,缺血再灌注组在肝十二指肠韧带远心端安置无损伤动脉钳钳夹肝蒂45分钟,于不同复流时间(0h、3h、12h、24h、72h)切取肝组织制备免疫组化及光镜观察标本,肝上下腔静脉取血测定生化指标。丹参预处理组断流前30分钟经尾静脉推注丹参注射液6g/kg加生理盐水40ml/kg。3.IGF-Ⅰ及Caspase-3免疫组化检测依说明书进行。IGF-Ⅰ以及Caspase-3阳性细胞判定方法为胞浆呈胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性反应。每张切片在400倍光学显微镜下随机选取5个视野,每个视野统计100个细胞中的阳性细胞数。采用全自动生化分析仪检测血清ALT和AST水平。采用光学显微镜观察肝组织细胞及细胞器病理形态学变化。4.用SPSS13.0进行分析。采用重复测量方差分析,组间比较用单因素方差分析,多重比较用LSD法。P＜0.05认为差异有显著性。结果正常对照组与假手术组各项检测指标无明显差异。未处理组与丹参组在再灌注3h时IGF-Ⅰ表达较正常对照组及假手术组均下降,12h时达到最低,24h时开始恢复,但丹参组下降程度较未处理组小;丹参组Caspase-3在0h、3h、12h、时与正常对照组及假手术组相比表达水平升高,但水平较未处理组低(P＞0.05),在24h及72h与未处理组无显著性差异(P＞0.05)。光镜下再灌注0h时丹参组及未处理组细胞仅轻度水肿,其余无明显改变;3h起丹参组肝细胞轻、中度水肿,少量炎细胞浸润,少数细胞脂肪变性,组织结构尚清晰,未处理组肝细胞明显肿胀,胞质内重度空泡样变性和脂肪变,部分细胞质降解,核仁缩小,凝集,肝窦内腔隙变窄;丹参组12h～24h肝细胞水肿略有加重,局部有点状坏死,但肝细胞结构排列尚规整;未处理组细胞质降解明显,肝血窦严重变窄,肝细胞索排列紊乱。72h时两组光镜下表现基本相同,肝细胞水肿变轻,可见少量新生肝细胞,肝血窦狭窄减轻。未处理组3h～12h外周血清ALT、AST浓度升高,24h时浓度开始下降,至72h时恢复正常。丹参组3h～12h ALT、AST也升高,24h时开始下降,此三组较同时间对照组升高程度低(P＜0.05),72h时恢复正常,与对照组无显著性差异(P＞0.05)。小结研究结果表明,肝缺血45min再灌注不同时限,丹参组IGF-Ⅰ表达强于未处理组,肝细胞损伤相对较轻,肝脏功能相对较好,其原因可能为,丹参通过促进微循环,抑制细胞损伤和死亡,改善细胞内的缺氧环境,促进肝细胞合成和分泌IGF-Ⅰ,上调IGF-Ⅰ表达水平,发挥其调节物质代谢,促进细胞增殖和分化功能,抑制细胞凋亡,由此实现在缺血再灌注损伤中对肝脏的保护作用。