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CYP74家族是植物细胞色素P450的一个家族,该家族成员包括AOS(丙二烯氧化物合酶)、HPL(脂氢过氧化物裂解酶)和DES(联乙烯醚合酶)。它们都是植物脂肪酸代谢过程中的酶,它们的催化产物在植物对发育和环境调控应答的许多过程中都具有重要的作用。本研究通过PCR的策略克隆了水稻中的HPL基因和一个新的AOS基因,并通过农杆菌介导的方法进行了水稻HPL基因的遗传转化,此外,还在基因组的水平上研究了CYP74家族在水稻基因组中的分布及特性。所获得的主要结果如下: 1、通过生物信息学的分析结合PCR的策略克隆了水稻HPL基因(OsHPL1),并构建了两个用于转化的双元表达载体:pPZPH2a3(+)-HPL1和pPZPH2a 3(-)-HPL1。这两个双元载体中分别插入了正义和反义的水稻HPL基因全长片段,同时这两个双元载体都是以CaMV 35S启动子驱动,选择标记基因都是潮霉素磷酸酶基因。 2、以农杆菌介导的方法用双元载体pPZPH2a3(+)-HPL1和pPZPH2a3(-)-HPL1分别对水稻品种日本晴(Nipponbare)进行了转化,用双元载体pPZPH2a 3(-)-HPL1对水稻品种北陆(FL2)进行了转化。上述三组转化总计获得了77个转基因单株。经潮霉素离体叶片抗性检测,阳性率为83.1%;PCR检测和T1代种子潮霉素抗性检测也都表明外源基因已经整合到水稻基因组中,Southern杂交显示,外源基因多数是以不止一个拷贝的形式整合进再生植株的。 3、通过生物信息学的分析结合PCR的策略发现并克隆了一个新的水稻AOS基因(OsAOS2)。构建了包含该基因全长的大肠杆菌原核表达载体pET30a-AOS2。初步的大肠杆菌原核表达实验表明OsAOS2基因在大肠杆菌体内是以包涵体的形式表达的,且表达量与IPTG诱导剂的浓度有关。 4、用生物信息学的方法对CYP74家族在水稻基因组内的分布进行了研究。BLAST分析表明,在水稻全基因组中总共存在5个CYP74家族成员。这5个成员中,1个是HPL基因(cYP74B亚家族),另外4个都是AOS基因(均为CYP74A亚家族),没有发现水稻基因组中存在CYP74c和CYP74D这两个亚家族的成员。这5个水稻CYP74基因都是单外显子基因,不含内元。序列分析表明这5个基因在两个亚种间序列差异都不