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研究背景及目的:结肠癌(colon cancer)是常见的消化道恶性肿瘤,半数以上由腺瘤癌变而来,其发生发展是一个多阶段、多步骤逐步演变的过程。目前具体病因尚未明确,传统上是以手术切除为主、联合化疗、放疗、生物靶向的综合治疗。由于存在细胞异质性,50%以上的结肠癌患者在根治术后仍出现复发、转移。进一步研究结肠癌的致病机制,为预防结肠癌的发生及改善预后具有重要的意义。转录因子BACH1(BTB and CNC homology 1)是一种血红素结合蛋白,广泛存在于哺乳动物的各类组织中,它参与调节血红蛋白平衡、氧化应激反应、调节细胞周期、抑制HO-1的表达。有研究表明,BACH1的低表达可以减少肠道、胰腺和心血管疾病的氧化损伤,BACH1参与癌症特别是乳腺癌的发病。Mohammadzadeh等发现敲除BACH1基因可降低CXCR4等在乳腺癌细胞的表达水平及侵袭性,被认为是治疗乳腺癌的潜在靶点。目前为止,BACH1在人类结肠癌中的作用及机制尚未得到阐明。CXCR4:是G蛋白偶联受体,在体内参与包括造血、发育、肿瘤转移、病毒感染等多种生理过程。有研究发现,CXCR4在正常黏膜、结肠息肉、结肠癌及癌转移灶中的表达水平依次增高,且在结肠癌中表达水平的高低,与肿瘤的恶性程度成正比。本研究探讨BACH1在正常组织和结肠癌中表达的差异,分析不同临床病理特征下BACH1表达与患者预后的相关性,通过构建体内、体外实验分析BACH1的功能,研究BACH1-CXCR4通路在人体结肠癌中的作用。方法:为分析BACH1表达水平与结肠癌患者临床特征及预后的关系,利用肿瘤基因图谱TCGA数据库,纳入192例结肠癌组织和mRNA序列,检测BACH1在mRNA水平的表达,并进行生存分析。并在90例结肠癌组织及90例正常对照组中采用免疫组化法观察BACH1的表达情况。构建BACH1沉默及过表达的HCT116细胞株,进一步观察其增殖、迁移和侵袭能力等细胞功能。采用稳转的BACH1过表达的HCT116细胞株,构建裸鼠的皮下移植瘤模型,观察移植瘤的生长速度,检测CD31、Vimentin的表达情况,评价肿瘤细胞的增殖和侵袭能力。采用蛋白质印迹、免疫组化法检测CXCR4,探讨BACH1和CXCR4的可能相关性,双荧光素酶报告系统确认BACH1直接调控的靶基因。1.免疫组织化学分析BACH1在临床结肠癌组织芯片中的表达情况。利用统计学方法,分析TCGA数据库中BACH1表达水平与结肠癌患者的临床特征和预后的相关性,通过生存曲线分析及Cox回归分析研究BACH1的表达与总体生存率的关系及是否可作为预后的预测因子。2.构建BACH1抑制表达和过表达的HCT116细胞株,细胞功能实验分析BACH1对结肠癌细胞功能的影响,以及靶基因CXCR4能否回复BACH1对结肠癌细胞引起的效应。3.BACH1过表达HCT116细胞株接种至裸鼠皮下组织构建皮下移植瘤模型,用于分析BACH1在体内对结肠癌成瘤的影响。4.免疫组织化学分析裸鼠皮下肿瘤组织中CD31及Vimentin的表达情况。蛋白质印迹法检测裸鼠皮下肿瘤细胞中CXCR4的表达情况。5.双荧光素酶报告系统确认BACH1转录调控的靶基因。结果:1.组织芯片免疫染色分析显示BACH 1在结肠癌组织标本中的表达水平远高于良性结肠组织,高表达的BACH 1与增强的肿瘤浸润及性别显著相关,具有统计学意义(P=0.028;P=0.014)。TCGA数据库分析发现BACH1表达水平与年龄、CEA水平、MSI状态显著相关(P=0.025;P=0.015;P=0.006)。2.Kaplan-Meier法和Log rank法分析结果显示高表达BACH1与结肠癌患者不良预后相关(P=0.015)。COX回归模型单因素和多因素分析显示,BACH1是结肠癌患者总生存的独立预测因子(P=0.049)。3.BACH1能显著促进HCT116细胞株的迁移和侵袭能力(P<0.01),干扰CXCR4表达能显著抑制BACH1过表达诱导的结肠癌细胞迁移和侵袭(P<0.01)。4.裸鼠皮下移植瘤实验结果显示过表达BACH1的HCT116细胞形成了明显较大的肿瘤结节,移植瘤的生长速度加快(P<0.01);同时BACH1过表达CD31血管数量及Vimentin蛋白表达量显著增加(P<0.01),表明BACH1可促进肿瘤的生长、血管生成和侵袭。5.蛋白质印迹和免疫组织化学结果显示,在结肠癌中BACH1 的表达与CXCR4呈正相关。6.双荧光素酶基因报告实验结果显示,与对照组比较,BACH1显著升高了携带PGL3-CXCR4序列的报告载体的活性(P<0.01),表明BACH11对CXCR4的调控作用是具有特异性的,检测位点确实是BACH1的结合位点。结论:1.BACH1在结肠癌中起促癌作用,促进结肠癌的进展,并作为独立预测指标预测术后结肠癌患者总生存。2.BACH1可通过BACH1-CXCR4通路促进结肠癌的进展,进一步揭示了结肠癌发生进展的分子机制,并有望成为结肠癌治疗的新靶标。