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Wilson病(Wilson’s disease)是一种多于青少年期起病的常染色体隐性遗传铜代谢障碍性疾病,也是目前少数可以治疗的神经遗传病。临床资料显示,以肢体扭转、行走和吞咽困难等为主要临床表现且病程较长的脑型WD患者常规驱铜疗效差、病情恢复慢,学习、工作和生活能力严重受限,严重者甚至危及生命。因此,这些难治性脑型WD患者的治疗是目前WD临床诊疗所面临的难题。本研究团队在前期研究中根据WD中医辩证研究结果,创用通腑养髓方治疗脑型WD患者获得明显临床疗效,并从神经元凋亡和自噬等角度对其疗效机制进行了系列研究。研究发现,除了铜蓄积直接导致神经元损伤外,铜蓝蛋白(ceruloplasmin,CP)合成障碍和亚铁氧化酶活性减低所致的细胞内铁稳态失衡是难治性脑型WD神经元损伤的重要机制,也是这些患者常规驱铜疗效不佳的主要原因。近年来的研究还发现,一种铁依赖性非程序性细胞死亡方式——ferroptosis与多种神经退行性疾病的发病关系密切,且与脑型WD的神经元损伤机制相契合。进一步的研究发现,泛素结合蛋白/死骨片1(ubiquitin-binding protein/Sequestosome-1,p62)-Kelch样环氧氯丙胺相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)-转录因子NF-E2相关因子2(nuclear factor-E2-related factor 2,NRF2)是ferroptosis的一个重要调控通路,激活该通路能阻断小分子化合物erastin等ferroptosis激活剂诱导的ferroptosis而具有细胞保护作用,是难治性脑型WD神经元损伤的潜在治疗靶点。基于此,本研究假设通腑养髓方通过调控p62-Keap1-NRF2通路阻断ferroptosis而具有神经元保护作用,研究通腑养髓方对WD模型TX小鼠神经元损伤的保护机制,尝试为难治性脑型WD患者提供新的治疗方法和思路。【目的】1.第一部分:观察WD模型TX乳鼠皮质神经元氧化应激水平及其损伤与ferroptosis的关系;2.第二部分:观察通腑养髓方对WD模型TX乳鼠皮质神经元ferroptosis氧化应激水平及p62-Keap1-NRF2通路相关蛋白表达的调控作用。【方法】1.分组:(1)第一部分分组:A.正常对照组:分离培养出生24h内DL小鼠乳鼠原代皮质神经元细胞;B.模型组:分离培养出生24h内WD模型TX乳鼠原代皮质神经元细胞;C.Fer-1组:在模型组中加入终浓度为60n M的ferroptosis抑制剂ferrostatin-1;D.HCQ组:在模型组中加入终浓度为20μM的自噬抑制剂羟氯喹(Hydroxychloroquine,HCQ);E.FMK组:在模型组中加入终浓度为50μM的凋亡抑制剂Z-VAD-FMK;F.Nec-1组:在模型组中加入终浓度为490n M的坏死抑制剂坏死稳定素1(Necrostatin-1,Nec-1)。(2)第二部分分组:A.正常对照组:分离培养出生24h内DL小鼠乳鼠皮质神经元细胞;B.模型组:分离培养出生24h内WD模型TX乳鼠皮质神经元细胞;C.中药组:在模型组中加入终浓度为10%的中药复方通腑养髓方含药血清;D.DFO组:在模型组中加入终浓度为300μM的去铁胺(Deferoxamine,DFO);E.ERA组:在中药组中加入终浓度为30μM的ferroptosis激活剂erastin。2.采用四唑盐(MTT)比色法检测TX乳鼠皮质神经元生存曲线及各组细胞给药24h后的细胞存活率。3.采用电感耦合等离子体质谱(Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICPMS)法检测各组细胞铁、铜元素含量。4.采用酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,Elisa)法检测肌张力障碍蛋白(dystonin,DST)、铁蛋白(ferritin,FER)、转铁蛋白(transferrin,TRF)、转铁蛋白受体(transferrin receptor,TFR)等铁代谢相关蛋白的表达水平。5.采用乳酸脱氢酶释放实验检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)漏出率。6.采用生化-酶标仪法检测各组细胞超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、氧化型谷胱甘肽(glutathione disulfide,GSSG)的水平。7.采用流式细胞仪法检测各组细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。8.采用蛋白质印迹法(Western Blotting,WB)法检测各组细胞p62、Keap1、NRF2、血红素氧合酶1(heme oxygenase 1,HO1)、醌氧化还原酶1(quinine oxidoreductase1,NQO1)、铁蛋白重链1(ferritin heavy chain 1,FTH1)等蛋白的表达。【结果】1.MTT:与正常对照组相比,模型组细胞存活率显著下降(P<0.01),在分离培养7天时约为50%;10%通腑养髓方含药血清组细胞存活率较5%、15%、20%高;2.细胞存活率:与模型组相比,Fer-1组、HCQ组、FMK组的存活率显著提高(P<0.01),Nec-1组存活率提高(P<0.05);中药组、DFO组、ERA组细胞细胞存活率显著提高(P<0.01);3.铁代谢相关蛋白:与正常对照组相比,模型组DST、TRF、TFR、FER蛋白表达显著下调(P<0.01);与模型组相比,Fer-1组DST、FER蛋白表达显著上调,TCM组DST、TRF、FER蛋白表达显著上调(P<0.01),TFR蛋白上调(P<0.05);4.铁、铜元素水平:与正常对照组相比,模型组Fe、Cu元素含量显著升高(P<0.01);与模型组相比,Fer-1组Fe、Cu元素水平无统计学差异;TCM组Fe元素水平显著下降(P<0.01),Cu元素含量下降,差异无统计学意义(P>0.05);5.活性氧ROS水平:与正常对照组相比,模型组细胞ROS显著上升(P<0.01)。与模型组相比,Fer-1组、HCQ组、FMK组、Nec1组ROS显著下降(P<0.01);中药组、DFO组、Era组细胞ROS显著下降(P<0.01);6.乳酸脱氢酶LDH漏出:与正常对照组相比,模型组细胞LDH漏出显著增多(P<0.01)。与模型组相比,Fer-1组、HCQ组、FMK组、Nec-1组细胞LDH漏出显著下降(P<0.01);中药组、DFO组、ERA组细胞LDH漏出率显著下降(P<0.01);7.超氧化物歧化酶SOD水平:与正常对照组相比,模型组SOD水平显著下降(P<0.01)。与模型组相比,Fer-1组、HCQ组、FMK组SOD水平显著上升(P<0.01),Necro-1组SOD水平上升(P<0.05);与模型组相比,中药组细胞SOD水平显著上升(P<0.01);8.丙二醛MDA水平:与正常对照组相比,模型组细胞MDA水平显著上升(P<0.01)。与模型组相比,Fer-1组、HCQ组、FMK组、Nec-1组MDA水平显著下降(P<0.01);与模型组相比,中药组、DFO组、Era组细胞SOD水平显著下降(P<0.01);9.还原型谷胱甘肽GSH水平:与正常对照组相比,模型组细胞GSH水平显著下降(P<0.01)。与模型组相比,Fer-1组、HCQ组组GSH水平上升(P<0.05);与模型组相比,中药组、DFO组细胞GSH水平上升(P<0.05);10.氧化型谷胱甘肽GSSG水平:与正常对照组相比,模型组细胞GSSG水平显著上升(P<0.01)。与模型组相比,Fer-1组、HCQ组、FMK组、Nec-1组GSSG水平显著下降(P<0.01);与模型组相比,中药组、DFO组、ERA组GSSG水平显著下降(P<0.01);11.蛋白质免疫印迹Western Blotting:与正常对照组相比,模型组细胞Keap1蛋白的表达显著上调(P<0.01),p62、NRF2、NQO1、HO1、FTH1蛋白表达显著下调(P<0.01)。与模型组相比,中药组p62、NRF2、NQO1、HO1、FTH1蛋白显著上调(P<0.01),keap1蛋白下调(P<0.01)。【结论】1.Ferroptosis诱导的氧化应激性损伤是WD模型TX小鼠神经元损伤的重要机制,抑制ferroptosis可以降低神经元氧化应激水平、提高TX乳鼠皮质神经元的生存率而具有神经元保护作用;2.中药复方通腑养髓方通过调控WD模型TX小鼠神经元的p62-Keap1-NRF2通路相关蛋白的表达水平(NRF2的表达水平上调,keap1的表达水平下调),并在一定程度上降低细胞内铁的含量,使得细胞内的氧化应激水平降低、细胞生存率提高而具有神经元保护作用。