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纤毛虫经过连续多代的无性分裂后，会逐渐衰老。如果这时能及时转入有性生殖周期，就会产生年轻的子代从而避免衰老和死亡的发生。在小腔游仆虫中，当年轻细胞经过分裂增殖到一定代数之后，就会获得接合生殖的能力，成为成熟细胞。当受到环境胁迫如食物缺乏时，成熟细胞能够通过配对的方式进行有性生殖，通过基因重组获得全新子代，从而保持物种的延续性。关于纤毛虫为何必须经历一定的分裂次数才能获得交配活性，以及由未成熟向成熟状态转变的过程发生了哪些机理上的变化目前仍无定论，这也是我们本课题的出发点。 本文以小腔游仆虫作为模型，通过抑制性消减杂交的技术手段，将性成熟后的游仆虫及未成熟年轻状态的游仆虫cDNA进行消减杂交，从而构建出了性成熟后高表达基因的cDNA文库。通过测序，我们从文库中获得了28个具有表达差异的基因的cDNA片段，这些基因在与蛋白及核酸数据库比对后，根据其相关的功能大体分为六大类：蛋白激酶相关基因(6个)；泛素及蛋白酶体相关基因(3个)；热激蛋白(HSP)相关基因(2个)；核糖体蛋白相关基因(3个)；细胞生长代谢相关基因(8个)及未知功能基因(6个)。其中的6个基因运用RACE的手段获得了cDNA全长序列，并通过半定量RT-PCR确认其在性成熟后的表达量明显高于未成熟细胞。 通过对小腔游仆虫成熟及未成熟细胞在饥饿后不同时间点(0小时、24小时、48小时)时各基因表达量水平的验证，最终我们选择了各时间点表达量在成熟细胞中都明显高于未成熟细胞的基因1-2-13做为下一步的研究对象，并将其命名为emat-1。软件对其核酸序列及蛋白质结构进行分析后发现，emat-1基因不含有内含子，可编码一个大小为约23kD的蛋白分子，该蛋白据推测在头部包含有一个15个氨基酸的信号肽分子，其定位可能在细胞膜上或分泌至细胞外。 在表达重组蛋白并获得多克隆抗体之后，我们在蛋白水平研究了emat-1的表达量和细胞定位。westernblotting结果表明，EMAT-1在成熟营养的小腔游仆虫中含量高于未成熟营养的小腔游仆虫，进一步印证了核酸水平RT-PCR的结果。免疫荧光的实验证实了EMAT-1存在于成熟小腔游仆虫的营养、饥饿及交配后25小时的细胞膜毛基索处，但在未成熟及交配后25小时之后的细胞的相同位置并无定位。这说明EMAT-1确实存在于成熟细胞的细胞膜上，并且参与了小腔游仆虫的性成熟及交配过程。在进一步试图对该基因在细胞内的具体功能进行研究时，我们遇到了很大的困难。基于普通的质粒载体转染及RNAi方法都无法应用于小腔游仆虫细胞的情况，我们构建了与其大核染色体结构相同的人工微染色体，并将Dsred荧光蛋白的序列整合在其中，但通过显微注射的方法都未能成功的让其在细胞内表达，加上细胞本身培养时间过长进入衰老期，失去了小核无法在交配后存活，使得该基因在小腔游仆虫中的功能研究陷入僵局。如果今后能在其它种的纤毛虫或更高等的动植物中发现emat-1的同源基因，将有可能对其在性成熟中的功能进行更深入的研究。 综上所述，本文以小腔游仆虫作为研究对象，通过抑制性消减杂交的技术手段筛选出了一批与其性成熟相关的基因，并对这些基因进行初步的生物学功能验证和分析，希望能够在深入理解真核生物的性成熟过程及有性生殖基因调控方面提供一定借鉴。另外作为新基因，emat-1的发现在遗传学上也具有重要的意义。 本文首次将抑制性消减杂交技术应用于小腔游仆虫的性成熟分子机理研究中，并对基因功能研究的技术手段进行了积极的探索，填补了在原生动物分子水平研究中技术手段的不足，为之后纤毛虫中的基础研究提供了借鉴和依据。