急性肺损伤／急性呼吸窘迫综合征(iute lung injury,ALI/acute respiratory distress syndrome,ARDS)是指发生于严重感染、休克、创伤及烧伤等疾病过程中,由于肺的毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤,肺泡毛细血管通透性增加,肺泡腔内含有蛋白的水肿液集聚,而引起的弥漫性肺间质水肿,并导致的以进行性低氧血症、呼吸窘迫为特征的临床综合征。就其病程阶段来看,急性肺损伤是急性呼吸窘迫综合征的早期阶段。就其病因来看,多种病因均可导致急性呼吸窘迫综合症,肺外源性肺损伤因素主要有：各种严重感染、脓毒症休克、出血坏死性胰腺炎、严重创伤应激、大面积烧伤、大量输血、弥散性血管内凝血(DIC)、严重过敏、羊水栓塞等。肺内源性肺损伤因素主要包括：重症肺炎、肺部创伤、肺栓塞、放射性肺炎、氧中毒、误吸、溺水等。报道显示：美国每年19万人发病,其中74500人死亡。因其病情进展迅速,病死率高,缺乏有效的治疗手段,已成为当前呼吸危重症领域亟待解决的难题。当前研究认为,环境内外多种致病因素导致的全身性炎症反应是ARDS的根本原因。当炎性细胞因子大量释放,导致肺组织出现炎性反应,从而使肺泡毛细血管通透性增加,肺泡内渗出的大量炎性体液难以清除,进而出现急性肺损伤的临床表现。核因子-κB(NF-κB)广泛存在于人体细胞中,它作为生物体内的一种转录因子,担负着重要的生理功能。在病理条件下,它能够起到调控炎症反应及细胞凋亡的作用。例如,经典的炎性细胞因子：肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)等就受到NF-κB的调控。以往大量实验证实,在脂多糖(LPS)等致炎因素的刺激下,NF-κB可以从细胞质转入细胞核,从无活性的状态变为活性结构,从而在转录水平启动各种炎性介质、趋化因子等基因转录,从而加剧炎症反应的程度和持续时间,在临床上呈现顽固性低氧血症和难治性呼吸衰竭。因此针对NF-κB活性位点的干预措施势在必行。纯天然植物产品由于其显著的疗效和毒性相对较低用来治疗ALI受到了广泛的关注。姜是多年生草本植物(zingiber ofFicinale Rose.),它的新鲜或干燥根茎就是我们日常生活中常用的生姜或者干姜。这种植物产于印度、南亚、东南亚,非洲,拉丁美洲和澳大利亚等地,可以单独使用或作为香料化合物以及药物使用。关于它的功效,最早在古代伊朗传统医学的食谱(ITM)中有记载,主要包括改善记忆和消化系统、壮阳、润肤、驱虫以及治疗咽喉痛、瘫痪、腹泻和阻塞性黄疸。生姜的现代植物疗法证实了其中的一些属性。有的属性仍有待研究。我国传统中医药理论认为,生姜味辛性温热,具有解毒、发散风寒、温中止呕、止咳化痰、温肺化饮等功效。随着现代中药提纯工艺和研究水平的提高,我们发现姜类化合物在抗炎、抗肿瘤治疗方面具有很好的疗效。6-姜烯酚(6-shogoal,6-SH)是干姜中的主要活性成分,具有治疗心血管疾病、胃溃疡、老年痴呆、肝病等生物学活性。最近,其抗炎、抗肿瘤、抗氧化效应等生物学活性亦逐渐得到了实验的印证。因此,关于6-姜烯酚的临床及基础研究备受国内外学者关注。研究表明,6-SH不仅可以抑制环氧化酶、花生四烯酸等生成,抑制脂多糖(LPS)诱导的前列腺素E2(PGE2)的产生,还能够抑制中性粒细胞激活及抑制TNF-a、IL-1p、IL-6等炎性细胞因子释放,但能否对急性肺损伤起到保护作用及其机制研究报道甚少。近年来,计算机技术蓬勃发展,通过计算机软件来辅助药物设计已日益成熟,因其迅捷、经济、高效的优势,在药物研发中发挥出日益重要的作用,其中,分子对接技术作为计算机辅助药物设计的关键技术,已成为药物研发中的一种重要方法,并成为国内外研究的前沿课题。分子对接的原理是基于受体与配体之间的相互作用,通过计算机软件技术来分析预测其结合模式及亲合力,从而实现基于分子结构的一种药物设计方法。在药物设计的实践中,我们发现它既可以针对药物分子和其相应的靶标之间的作用信息,也可以用来开发具有潜在作用的新药。随着计算机软件的迅猛发展,一些简便易用的蛋白质模拟、药物的设计与优化工具应运而生。通过高质量的图形界面、科学的函数计算以及集成的数字环境,使微观的蛋白质结构与功能呈现于眼前。这种方法能够从整体上观察到配体与受体的结合效果,很好地避免了其他方法只研究微观表现,而缺乏整体认识的弊端,因此,分子对接的方法可以与基因、蛋白表达方法互为补充,相得益彰。因此,本课题拟通过复制LPS诱导的ALI小鼠动物模型,从肺泡毛细血管通透性、炎症因子表达、肺组织病理学表现、NF-κB定量分析及6-SH与NF-κB分子对接构象分析五个方面探讨6-姜烯酚对ALI的保护作用及机制。第一部分6-姜烯酚对脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠肺泡毛细血管通透性的影响目的研究6-姜烯酚(6-shogoal,6-SH)对脂多糖(Lipopolysac-charide,LPS)诱导的急性肺损伤(Acute Lung Injury,ALI)小鼠肺泡毛细血管通透性的影响。方法 健康雄性小鼠72只,随机分为6组(n=12)：生理盐水对照组(NS组),LPS模型组(L组),6-姜烯酚处理组1(L+SH1组,10mg/kg),6-姜烯酚处理组2(L+SH2组,20mg/kg),6-姜烯酚处理组3(L+SH3组,40mg/kg),地塞米松处理组(L+DEX 5mg/kg)。(1)生理盐水对照组(NS组)：腹腔注射0.9%氯化钠注射液(NS),1小时后经鼻气管内滴入NS50μl; (2)LPS模型组(L组)：腹腔注射0.9%氯化钠注射液(NS),1小时后经鼻气管内滴入LPS (10μg/50μl) (3)6-姜烯酚处理组1(L+SH1组,10mg/kg):腹腔注射6-姜烯酚(6-SH 10mg/kg),1小时后经鼻气管内滴入LPS (10μg/50μl) (4)6-姜烯酚处理组2(L+SH2组,20mg/kg):腹腔注射6-姜烯酚(6-SH 20mg/kg),1小时后经鼻气管内滴入.LPS(10μg/50μl)(5)6-姜烯酚处理组3(L+SH3组,40mg/kg):腹腔注射6-姜烯酚(6-SH 40mg/kg),1小时后经鼻气管内滴入LPS (10μg/50μl)。(6)地塞米松处理组(L+DEX组,5mg/kg):腹腔注射地塞米松(DEX 5mg/kg),1小时后经鼻气管内滴入LPS(10μg/50μl)。LPS或NS滴入后6h,颈动脉放血处死动物。检测每组动物支气管肺泡灌洗液(BALF)中总细胞数,中性粒细胞百分比,白蛋白浓度,检测肺组织湿重与干重比(W/D)。实验数据用均数±标准差表示,实验组之间的比较采用Dunnet T检验,检验水准a=0.05,p≤0.05认为差异有统计学意义,数据处理采用SPSS17.0。结果(1)BALF总细胞数：Dunnett方差分析显示,与NS相比,L组BALF总细胞数增多,差异有统计学意义(p<0.01),与L组相比,6-SH组和DEX组BALF中总细胞数降低(p<0.01)。(2)BALF中性粒细胞数百分比：与NS组比较,L组BALF中性粒细胞数百分比升高(p<0.01)；与L组比较,6-SH组和DEX组BALF中中性粒细胞数百分比降低(p<0.01)；(3)BALF白蛋白浓度：与NS组比较,L组BALF白蛋白浓度升高(P<0.01)；与L组比较,6-SH组和DEX组BALF中白蛋白浓度降低(p<0.01),差异有显著性。(4)W/D：与NS组比较,L组肺组织W/D升高(P<0.01)；与L组比较,6-SH组和DEX组W/D降低(P<0.01)。结论6-姜烯酚能够减轻LPS诱导的ALI,其部分机制可能与抑制中性粒细胞浸润、降低肺泡毛细血管通透性、减轻肺水肿有关,其效果与激素的抗炎作用相似。第二部分6-姜烯酚对脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠肺泡灌洗液炎症因子的影响目的 研究6-姜烯酚对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导急性肺损伤(Acute Lung Injury,ALI)小鼠肺泡灌洗液炎症因子的影响。方法 健康雄性小鼠72只,随机分为6组(n=12)：生理盐水对照组(NS组),LPS模型组(L组),6-姜烯酚处理组1(L+SH1组,10mg/kg),6-姜烯酚处理组2(L+SH2组,20mg/kg),6-姜烯酚处理组3(L+SH3组,40mg/kg),地塞米松处理组(L+DEX 5mg/kg)。(1)生理盐水对照组(NS组)：腹腔注射0.9%氯化钠注射液(NS),1小时后经鼻气管内滴入NS50μl; (2) LPS模型组(L组)：腹腔注射0.9%氯化钠注射液(NS),1小时后经鼻气管内滴入LPS(10μg/50μl)(3)6-姜烯酚处理组1(L+SH1组,10mg/kg):腹腔注射6-姜烯酚(6-SH 10mg/kg),1小时后经鼻气管内滴入LPS (10μg/50μl )(4)6-姜烯酚处理组2(L+SH2组,20mg/kg):腹腔注射6-姜烯酚(6-SH 20mg/kg),1小时后经鼻气管内滴入LPS(10μtg/50μl)(5)6-姜烯酚处理组3(L+SH3组,40mg/kg):腹腔注射6-姜烯酚(6-SH 40mg/kg), 1小时后经鼻气管内滴入LPS (10μg /50μl)。(6)地塞米松处理组(L+DEX组 ,5mg/kg):腹腔注射地塞米松(DEX 5mg/kg), Ⅰ小时后经鼻气管内滴入LPS (10μg/50μl)。LPS或NS滴入后6h,颈动脉放血处死动物。每组动物检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞介素-113 (IL-1β),肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、白细胞介素-6(IL-6)的浓度。实验数据用均数±标准差表示,实验组之间的比较采用Dunnet T检验,检验水准a=0.05,p≤0.05认为差异有统计学意义,数据处理采用SPSS17.0.结果(1)TNF-a:与NS组比较,L组肺组织TNF-a浓度升高(P<0.01)；与L组相比,6-SH组和DEX组肺组织TNF-a浓度降低(P<0.01)。(2) IL-1β:与NS组比较,L组肺组织IL-1p浓度升高(P<0.01)；与L组相比,6-SH组和DEX组肺组织IL-1p浓度降低(P<0.01) (3)IL-6:与NS组比较,L组肺组织IL-6浓度升高(P<0.01)；与L组相比,6-SH组和DEX组肺组织IL-6浓度降低(P<0.01)。结论6-姜烯酚能够抑制LPS诱导的ALI小鼠肺泡灌洗液中TNF-a、IL-1 β、IL-6浓度,其肺保护作用可能与抑制炎症因子有关。第三部分6-姜烯酚对脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性及肺组织病理学变化的影响目的研究6-姜烯酚对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的急性肺损伤(Acute Lung Injury,ALI)小鼠肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性及肺组织病理学变化的的影响。方法 健康雄性小鼠72只,随机分为6组(n=12)：生理盐水对照组(NS组),LPS模型组(L组),6-姜烯酚处理组1(L+SH1组,10mg/kg),6-姜烯酚处理组2(L+SH2组,20mg/kg),6-姜烯酚处理组3(L+SH3组,40mg/kg),地塞米松处理组(L+DEX 5mg/kg)。(1)生理盐水对照组(NS组)：腹腔注射0.9%氯化钠注射液(NS),1小时后经鼻气管内滴入NS50μl; (2)LPS模型组(L组)：腹腔注射0.9%氯化钠注射液(NS),1小时后经鼻气管内滴入LPS (10μg/50μl)(3)6-姜烯酚处理组1(L+SH1组,10mg/kg):腹腔注射6-姜烯酚(6-SH 10mg/kg),1小时后经鼻气管内滴入LPS (10μg/50μl)(4)6-姜烯酚处理组2(L+SH2组,20mg/kg):腹腔注射6-姜烯酚(6-SH 20mg/kg),1小时后经鼻气管内滴入LPS(10μg/50μl)(5)6-姜烯酚处理组3(L+SH3组,40mg/kg):腹腔注射6-姜烯酚(6-SH40mg/kg),1小时后经鼻气管内滴入LPS (10μg/50μl)。(6)地塞米松处理组(L+DEX组,5mg/kg):腹腔注射地塞米松(DEX 5mg/kg),1小时后经鼻气管内滴入LPS (10μg/50μl)。LPS或NS滴入后6h,颈动脉放血处死动物。取部分肺组织进行病理切片染色,其余肺组织用来检测肺组织匀浆中髓过氧化物酶(MPO)活性,实验数据用均数±标准差表示,实验组之间的比较采用Dunnet T检验,检验水准a=0.05,p≤0.05认为差异有统计学意义,数据处理采用SPSS17.0。结果病理所见：生理盐水对照组表现为小鼠肺组织结构正常,细胞完整,肺泡腔清晰可见,肺泡间隔未见水肿及炎细胞浸润。L组出现的肺损伤改变明显：包括肺泡结构破坏、细胞破坏、肺泡壁严重水肿、肺间质部分增厚、肺泡腔渗出增多,大量炎性细胞浸润、血管充血、出血。6-SH组和DEX组,均有不同程度的肺损伤,但较L组损伤减轻,其肺泡组织结构尚可,肺间质和肺泡腔内渗出物较L组明显减少,炎性细胞浸润现象亦减轻。MPO：与NS组比较,L组肺组织MPO活性升高(P<0.01)；与L组相比,6-SH组和DEX组肺组织MPO活性降低(P<0.01)。结论 1、组织病理学检查证实：6-姜烯酚能够改善病理状态下的肺组织,且成剂量依赖性。2、6-姜烯酚的肺组织保护作用可能与抑制MPO活性相关。第四部分6-姜烯酚对脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠肺组织NF-κB信号通路的抑制作用目的研究6-姜烯酚对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的急性肺损伤(Acute Lung Injury, ALl)小鼠肺组织NF-κB信号通路的影响。方法 健康雄性小鼠72只,随机分为6组(n=12)：生理盐水对照组(NS组),LPS模型组(L组),6-姜烯酚处理组1(L+SH1组,10mg/kg),6-姜烯酚处理组2(L+SH2组,20mg/kg),6-姜烯酚处理组3(L+SH3组,40mg/kg),地塞米松处理组(L+DEX 5mg/kg)。(1)生理盐水对照组(NS组)：腹腔注射0.9%氯化钠注射液(NS),1小时后经鼻气管内滴入NS 50μl; (2) LPS模型组(L组)：腹腔注射0.9%氯化钠注射液(NS),1小时后经鼻气管内滴入LPS (10μg/50μl)(3)6-姜烯酚处理组1(L+SH1组,10mg/kg):腹腔注射6-姜烯酚(6-SH 10mg/kg),1小时后经鼻气管内滴入LPS (10μg/50μl)(4)6-姜烯酚处理组2(L+SH2组,20mg/kg):腹腔注射6-姜烯酚(6-SH 20mg/kg), 1小时后经鼻气管内滴入LPS(10μg/50μl)(5)6-姜烯酚处理组3(L+SH3组,40mg/kg):腹腔注射6-姜烯酚(6-SH 40mg/kg), 1小时后经鼻气管内滴入LPS(10μg /50μl)。(6)地塞米松处理组(L+DEX 组,5mg/kg):腹腔注射地塞米松(DEX 5mg/kg),1小时后经鼻气管内滴入LPS (10μg/50μ1)。LPS或NS滴入后6h,颈动脉放血处死动物。取部分肺组织液氮保存,用Western Blotting检测肺组织NF-κB表达情况。实验数据用均数±标准差表示,实验组之间的比较采用Dunnet T检验,检验水准α=0.05,p≤0.05认为差异有统计学意义,数据处理采用SPSS17.0。结果L组肺组织细胞核内NF-κB p65含量显著高于生理盐水对照组,差异有统计学意义(P<0.01)；与L组相比,6-SH干预组肺组织细胞核内NF-κB p65含量下降,差异有统计学意义(P<0.01)。结论6-姜烯酚的肺组织保护作用可能与抑制NF-κB表达相关。第五部分6-姜烯酚与NF-κB分子对接蛋白构象分析目的利用分子对接技术,研究受体-配体间相互的作用,通过对6-姜烯酚与NF-κB分子对接蛋白构象分析,评价6-姜烯酚对NF-κB信号通路的影响。方法使用Discoveray Studio 2.5新一代分子建模和模拟环境软件,基于形状匹配的分子对接程序,采用模拟蒙特卡罗方法在LigandFit模块中将6-姜烯酚与NF-κB分子的活性位点进行柔性对接,观察配体结合取向、结合构象以及形状匹配等多种表现。整个过程分为9步：(1)载入受体蛋白文件(2)定义受体,在受体中搜索结合位点(3)运行对接流程分析对接结果(4)优化对接poses(5)配体对接pose的优化(6)对优化后的对接poses重新打分(7)分析优化后重新打分的配体pose(8)运行一致性打分(Consensus Score)流程(9)分析一致性打分结果结果6-SH与NF-κB的Lys145和Lys146氨基酸残基末端结合,并且与Lysl45之间产生交互作用。同时,6-SH能够作用于深埋于NF-κB位于A链和B链之间的活性位点,它们是位于NF-κB p50 B链的深裂内层结构的氨基酸残基Tyr57, Val58, Cys59,Tyr143, Lys145, Lys146o最终一致性分析得分为41.27,配体内部的能量为-3.52。结论6-姜烯酚通过与NF-κB活性位点结合,影响其调控的信号转导通路。