Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是一类Ⅰ型跨膜的模式识别受体(Pattern recognitionreceptors,PRRs),其作为免疫哨兵分子能够识别不同的病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)、活化核转录因子 κB(Nuclear factorκB,NF-κB),从而激活天然免疫应答,诱导炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素的产生,在抵抗和清除病原微生物的感染中发挥了关键作用。TLRs活化后诱导MyD88(Myeloid differentiation factor 88)依赖的NF-κB活化,促进前炎性细胞因子和趋化因子的产生。在MyD88非依赖的信号通路中,TLRs可直接招募TRIF(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β),与 TRAF6 相互作用激活 NF-κB,也可与 TBK1 互作激活IRF3(Interferon regulatory factor 3)。TLR和下游的适配蛋白含有一个进化上保守的细胞质区域,即TIR(Toll/IL-1 receptor)结构域,可形成同源或异源二聚体,对TLR信号通路的转导尤为重要。TLR信号通路的异常或过度活化会引起炎性反应,许多感染性疾病、自身免疫病和恶性肿瘤都会引发机体产生过度炎症反应,因而靶向天然免疫应答和信号转导的药物具有潜在的医疗前景。沙门菌是一类重要的食源性人兽共患肠道致病菌,可在人和多种动物中引起局部感染,甚至造成严重的全身性疾病,包括胃肠炎、腹泻和伤寒等疾病。沙门菌可通过Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)分泌多种毒力效应蛋白促进其在体内的定殖,沙门菌致病岛(Salmonellapathogenicityisland,SPI)编码的效应蛋白通过T3SS直接进入宿主细胞,进而调控细胞的生化过程。SPI-1和SPI-2在沙门菌的感染过程中尤为重要,这些效应蛋白在沙门菌感染期间具有多种作用,包括参与宿主细胞骨架的重排、免疫细胞的募集、细胞代谢、体液分泌以及宿主炎症反应的调控。沙门菌已经进化出多种逃逸或操纵宿主免疫防御的策略以促进其在宿主中的生存。本研究鉴定了肠炎沙门菌含TIR结构域基因tcpS,探究了其序列结构特征、表达分泌特性和动态感染规律;通过体内外实验研究了 TcpS对肠炎沙门菌毒力的影响;揭示了抑炎效应蛋白TcpS干扰TLR信号通路以逃逸宿主天然免疫的分子机制;通过小鼠模型鉴定了 TcpSTIR结构域功能性肽段的抑炎抗感染功效。本研究揭示了肠炎沙门菌逃逸机体天然免疫的新机制,亦为新型抑炎小分子药物的设计提供了新思路。1.肠炎沙门菌TcpS生物信息学分析及其表达分泌规律研究通过生物信息学方法鉴定肠炎沙门菌C50041中存在含TIR结构域基因tcpS(TIR-and Coiled-coil-domain containing Protein of Salmonella)。TcpS 位于 ROD21(Region of difference 21)5’asn tRNA岛,其附近含有噬菌体整合酶和接合转移蛋白。通过PCR方法鉴定tcpS基因在不同血清型沙门菌和其它细菌中的分布,结果显示tcpS仅存在于肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌和都柏林沙门菌中。引入沙门菌lygD和flhB两个基因,建立了基于tcpS的多重PCR检测方法,可快速高效鉴定这三种血清型沙门菌。TcpS蛋白共含有293个氨基酸,其羧基端137个氨基酸为TIR结构域。TcpS与TLR4/MyD88 TIR结构域的氨基酸相似性约为40%。TIR结构域有三个较为保守的基序:Box 1、Box 2和Box 3,其对TLR信号转导尤为重要。将TcpS TIR的三个Box与不同TLRs和适配蛋白进行比较,结果显示TcpS Box 1序列与其它蛋白高度相似。生物信息学分析表明TcpS的三维结构与其它蛋白TIR结构域具有高度的相似性和较好的空间重叠性。利用原核表达系统表达TcpS蛋白并制备TcpS多抗血清,将肠炎沙门菌C50041单独培养或与RAW264.7细胞共培养后分别检测TcpS的表达,结果显示在细菌沉淀中可检测到TcpS,表明肠炎沙门菌C50041可组成型表达TcpS蛋白,即tcpS不是假定基因。与RAW264.7细胞共培养后,可在培养基上清中检测到TcpS,表明共培养可促进TcpS的分泌。构建C50041 ΔSPI-1和ΔSPI-2缺失株,通过Transwell实验鉴定C50041菌株表达并分泌TcpS蛋白,结果显示C50041感染组上区室中可检测到TcpS,下区室的上清中未检测到DnaK,表明TcpS蛋白是由细菌分泌出来的。在SPI-1缺失后,TcpS的分泌水平显著降低,而SPI-2缺失不会影响其分泌,表明TcpS可通过T3SS1分泌至胞外。构建 C50041 ΔtcpS、C50041 ΔtcpS+pCX340 和 C50041 ΔtcpS+pCX340-TcpS,将表达各融合蛋白的沙门菌感染HeLa细胞,利用CCF2/TEM-1报告系统鉴定TcpS可分泌至细胞内。结果显示TEM-1和TcpS-TEM-1融合蛋白均成功表达,表达TEM-1的沙门菌感染后细胞呈现绿色荧光,表明TEM-1未转运至胞内,而表达TcpS-TEM-1的沙门菌感染后细胞呈现蓝色荧光,表明TcpS-TEM-1成功转运至胞内,并将CCF2底物进行分解。将肠炎沙门菌C50041进行灌胃攻毒,并在灌胃后不同时间点采集小鼠肝脏,荧光定量PCR检测沙门菌促炎和抑炎效应蛋白以及小鼠细胞因子的水平。结果显示抑炎效应蛋白(tcpS、avrA和sptP)在感染后24 h-2 d表达水平较高,促炎效应蛋白(sopB、sopE、srfA和sopD)在感染后24 h最高,小鼠细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12p40、IFN-γ、CXCL2和CCL4)则在感染后12 h和7 d时表达水平最高。表明在感染早期沙门菌通过降低促炎效应蛋白并增加抑炎效应蛋白来抑制细胞因子的产生,并且TcpS的动态感染规律与其它抑炎效应蛋白较为一致。2.肠炎沙门菌抑炎效应蛋白TcpS对细菌毒力的影响构建肠炎沙门菌C50041 ΔtcpS缺失株和C50041 ΔtcpS+pBR322-TcpS回复株,细菌生长曲线显示TcpS野生株、缺失株和回复株的生长速率较为一致。以RAW264.7细胞为感染模型,检测TcpS对细菌的侵袭率、增殖率和炎性细胞因子表达的影响。结果显示C50041和TcpS回复株比ΔtcpS缺失株具有更高的侵袭率和增殖率,而炎性细胞因子IL-6和IL-1p显著低于ΔtcpS缺失株感染组。表明在细胞水平上,TcpS能显著抑制细胞因子的产生,并促进细菌在胞内的定殖。与野生株相比,回复株中TcpS过量表达,对TLR信号通路的抑制作用更为明显,因而具有更低的炎性细胞因子水平以及更高的侵袭率和增殖率。将肠炎沙门菌C50041、ΔtcpS和ΔtcpS+pTcpS分别感染BALB/c小鼠,攻毒4天后分别收集肝脏和脾脏,检测脏器中的炎性细胞因子水平、载菌量和组织病理学变化。结果显示,C50041野生株和TcpS回复株在肝脏和脾脏中的载菌量显著高于ΔtcpS缺失株感染组,表明TcpS可在体内促进细菌的存活。与ΔtcpS缺失株相比,C50041野生株和TcpS回复株可抑制脏器中CXCL15、TNF-α、IL-6和IL-1β的产生,表明TcpS可在体内外抑制炎性细胞因子的产生,并促进细菌在胞内的增殖。组织病理学分析显示在感染早期TcpS能够抑制组织炎性反应,ΔtcpS缺失株感染组小鼠的肝脏和脾脏炎性浸润程度显著高于野生株和TcpS回复株感染组,而在感染后期ΔtcpS缺失株感染组小鼠的肝脏和脾脏则恢复正常。这些结果表明在感染早期沙门菌效应蛋白TcpS能够抑制炎症反应,逃逸宿主的天然免疫从而促进细菌在胞内的生存。在感染后6天采集小鼠血清,沙门菌野生株和TcpS回复株感染组小鼠的血清颜色为深红色,而ΔtcpS缺失株感染组小鼠血清呈现为正常的浅黄色。检测小鼠血清中血红蛋白的含量,结果显示沙门菌野生株和TcpS回复株在感染后期可导致小鼠血液中红细胞的破碎和血红蛋白的释放,且肝脏和脾脏均出现了较为严重的病理损伤。通过ELISA检测感染后期小鼠血清中炎性细胞因子,结果显示野生株和回复株感染组小鼠血清中炎性细胞因子IL-12p40、TNF-α IL-1β和IL-6水平显著高于缺失株感染组,表明TcpS在感染早期逃逸天然免疫并促进细菌的存活,导致感染后期产生炎性风暴和组织病理损伤。在沙门菌攻毒后期,野生株和TcpS回复株攻毒组小鼠的毛发明显凌乱无光泽、食欲减退、没有活力。通过生存曲线评价了 TcpS在沙门菌逃逸天然免疫过程中对细菌毒力的影响,结果显示ΔtcpS缺失株感染的小鼠死亡率显著降低。以小鼠动物模型进行LD50攻毒实验,LD50结果显示沙门菌野生株和TcpS回复株的LD50分别为1.7 ×105 CFU 和 4.5 × 105CFU,而 ΔtcpS 缺失株的 LD50 为 5.4 × 106CFU,表明 TcpS 缺失后沙门菌毒力减弱,是逃逸机体免疫系统的一种新型毒力效应蛋白。3.肠炎沙门菌TcpS干扰宿主天然免疫的分子机制研究以HEK293T和RAW264.7为细胞模型,利用NF-κB荧光素酶报告系统检测TcpS对TLR信号通路的抑制作用,结果显示TcpS可抑制TLR2、TLR4、TLR5、TLR7和TLR9介导的NF-κB的活化,且抑制作用存在剂量依赖关系。此外,TcpS能强烈抑制TLR3介导的IFN-β和NF-κB的活化,而TLR3信号通路的活化是MyD88非依赖的,表明TcpS可同时抑制MyD88和TRIF介导的TLRs的活化。过表达MyD88和TRIF可显著激活NF-κB和IRF通路,而TcpS能够有效抑制MyD88和TRIF介导的NF-κB和IRF的活化,MyD88和TRIF特异的siRNA干扰实验进一步证明TcpS的抑制作用是由MyD88和TRIF介导的。为证明MyD88是TcpS发挥抑制功能所必需的,将肠炎沙门菌C50041野生株、ΔtcpS缺失株和TcpS回复株分别感染C57BL/6J WT和MyD88-/-BMMs细胞,荧光定量PCR检测炎性细胞因子水平、细菌的侵袭率和增殖率,结果显示在WT BMMs细胞中,TcpS可促进细菌在胞内的侵袭和增殖,并抑制IL-1β的表达;而在MyD88-/-BMMs细胞中,TcpS丧失了抑制炎症反应和促进细菌增殖的能力,表明MyD88在TcpS发挥抑炎功能中的重要作用。利用免疫共沉淀方法检测TcpS与MyD88之间的相互作用,结果显示TcpS与MyD88之间存在直接的相互作用,表明TcpS可通过与MyD88相互作用直接干扰其介导的天然免疫。将TcpS真核表达质粒转染HeLa细胞,LPS刺激后通过激光共聚焦显微镜观察p65亚基在细胞内的定位,结果显示TcpS可显著抑制p65的入核,并具有剂量依赖关系。将TcpS/TLR4/MD2转染HEK293T细胞,LPS刺激后检测TcpS对炎性细胞因子表达的影响,结果显示TcpS能够显著抑制LPS诱导的IL-1β、IL-8、IL-17A和TNF-α的表达。此外,在HeLa细胞中,TcpS可抑制LPS诱导的炎性细胞因子IL-1β的表达,表明TcpS能够干扰TLR-NF-κB信号通路进而阻断天然免疫系统。为鉴定TcpS TIR结构域中发挥抑炎功能的关键氨基酸,选择可能对点突变较为敏感的氨基酸位点并构建一系列关键氨基酸突变体。将TIR-TcpS和各突变体转染细胞后,检测各突变体对NF-κB活化和IL-8分泌水平的影响,结果显示E180A减弱了其抑制作用,而Y191A和I284A则完全废除了其抑制作用。尤为注意的是,TIR-TcpS对TLR信号通路的抑制作用显著弱于全长TcpS,表明TcpS的氨基端序列在其发挥抑炎作用中具有重要作用。生物信息学分析表明TcpS除羧基端TIR结构域外,在其氨基端含有 Coiled-coil(CC)结构域。将 pCMV-HA-TcpS 和 pCMV-HA-ACCTcpS 分别转染HEK293T细胞,检测CC结构域对TcpS功能的影响,结果显示全长TcpS可显著抑制NF-κB的活化和IL-8的分泌,而ACCTcpS的抑炎效果则大幅降低,表明CC结构域在TcpS发挥高效抑制TLR信号通路中具有重要作用。将pFlag-TcpS和pFlag-ΔCCTcpS分别与pMyc-TcpS共转染HEK293T细胞,通过免疫共沉淀试验检测TcpS是否会形成同源二聚体,结果表明Myc-TcpS和Flag-TcpS存在相互作用,且其相互作用是通过CC结构域实现的。TcpS Coiled-coil结构域是由两个两性α螺旋相互缠绕形成的超螺旋,能够增强TcpS与TLRs或其它含TIR适配蛋白的结合能力。这些结果表明TcpS通过其氨基端Coiled-coil结构域形成同源二聚体,使其高效阻断TLR信号通路,进而抑制炎性反应。4.TcpS TIR结构域功能性肽段的抑炎抗感染功效通过生物信息学方法分析TcpS的TIR结构域,将TIR-TcpS划分为6个多肽区域,在小鼠原代腹腔巨噬细胞中检测各多肽对TLR4信号通路的抑制作用。结果显示,所有多肽尤其是SR2、SR3、SR4、SR5和SR6能够显著抑制MyD88介导的IL-1β和TNF-α的产生,多肽SR3和SR5可中度抑制IFN-β的产生,而SR2、SR5和SR6可抑制RANTES的产生。不同多肽对LPS诱导的p-ERK的活化均有不同程度的抑制作用,其中SR3、SR5和SR6的抑制作用尤为明显,SR6甚至消除了其活化,这些多肽可能是TcpSTIR结构域中潜在的功能性TIR-TIR结合位点。使用SWISS-MODEL在线预测了各多肽在TcpS TIR空间结构中的位置,这些多肽均位于TIR结构的表面并环绕着TIR球形结构,预示着这些位点可以更直接地与其它分子进行相互作用。将初筛的功能TIR-TcpS多肽SR4、SR5和SR6分别腹腔注射小鼠,再以亚致死剂量LPS进行攻毒,检测小鼠血清中炎性细胞因子的分泌水平,进而确定TcpS多肽对小鼠的免疫保护作用。引人注意的是,在LPS攻毒后,PBS组小鼠血清呈现深红色,而LPS未攻毒组的小鼠血清则呈现正常的浅黄色。SR4、SR5和SR6多肽均可缓解颜色的加重,尤其是SR4处理组可防止血清颜色的变化。此外,LPS注射后可大幅增加血清中血红蛋白的含量,而多肽处理则可显著降低血红蛋白的释放。三种多肽均可有效抑制小鼠血清中炎性细胞因子IL-6、IL-12p40和TNF-α的产生,甚至恢复至正常水平。这些结果表明SR4、SR5和SR6多肽在体内具有良好的抑炎效果,对LPS攻毒具有良好的保护作用。为检测多肽对细胞活性的影响,将不同TIR-TcpS多肽与小鼠腹腔巨噬细胞进行孵育,通过MTT试验评价细胞活性。结果显示SR1、SR3和SR4多肽处理后,细胞活性仍大于90%,甚至与培养基处理组相当。因此,TcpSTIR衍生的多肽SR4可在体内外阻断TLR介导的炎症反应,且对细胞活性影响较小。在小鼠模型中检测了 SR4多肽对流感病毒的攻毒保护作用,结果显示在H1N1流感病毒感染后,PBS和对照多肽CP组小鼠的体重急剧地连续下降(27%和29%),而SR4处理组小鼠的体重有轻微的下降(5.5%),表明SR4多肽能够调节机体病理状态下的免疫系统,从而抵抗流感病毒的感染。TIR-TcpS多肽可抑制LPS介导的过度炎症反应,并具有抗病毒感染功效,其可作为过度炎性反应或自身免疫性疾病的潜在治疗药物。