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研究背景与目的心血管疾病已经上升为全世界死亡率最高的疾病,随着科技的进步以及医疗水平的提高,心血管疾病的研究和防治也得到了极大发展。其中,衰老对心血管疾病发生发展的影响越来越受到关注和重视。血管平滑肌细胞的衰老是血管衰老的基础,探索其机制对预防血管衰老,防治心血管系统及其他系统衰老相关性疾病具有十分重要的意义。硫化氢（hydrogen sufide,H2S）曾被认为是生物体内的一种代谢废物,现已被证明是体内一种重要的具有生物学活性的气体信号分子。有研究证明,H2S具有延缓细胞衰老的效应,其机制尚待进一步阐明。Klotho基因是一种“抗衰老”基因,目前学术界普遍认为分泌型的Klotho蛋白是一种与人冠状动脉疾病相关的抗衰老激素,可通过抑制FoxO1磷酸化以增强FoxO1活性,继而发挥抗衰老的效应。已有文献报道H2S可调节神经细胞内的Klotho表达。本研究目的在于探索Klotho/FoxO1途径在H2S抗过氧化氢诱导的平滑肌细胞衰老中的作用。方法与结果1.用H2O2浓度（0、25、50、100、150μmol/L）处理细胞1小时,更换完全培养基,置于二氧化碳培养箱（37℃、5%CO2）中培养24小时。用Western blotting和β-半乳糖苷酶染色的方法检测细胞衰老,选择最适H2O2浓度。结果显示:对照组（0μmol/L H2O2组）、25μmol/L、50μmol/L H2O2组β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率分别为5%、10%和13%左右。100μmol/L H2O2组的阳性细胞率显著增多（65%左右）,为对照组的13倍（P﹤0.01）。Western blotting检测表示:与对照组相比,100μmol/L H2O2组的P16、P21和P53蛋白表达显著上调,各增加了288.8%、200.8%、175.4%（P﹤0.01）。结果表明,100μmol/L H2O2诱导血管平滑肌细胞衰老效果最佳。2.先分别用0、25、50、100、200μmol/L NaHS处理血管平滑肌细胞30分钟,再用100μmol/L H2O2处理1小时,更换完全培养基,置于培养箱（37℃、95%O2-5%CO2）中培养24小时。然后应用Western blotting检测相关蛋白,并进行β-半乳糖苷酶染色。结果显示:对照组（0μmol/L NaHS组）β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率高,约63%。25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L NaHS组的阳性细胞率分别为47%、25%、15%和12%,与对照组比较均降低（P﹤0.01）。Western blotting检测表示:与对照组相比,100μmol/L NaHS组的P16、P21和P53蛋白表达分别降低了143.6%、166.4%、319.6%（P﹤0.01）。200μmol/L NaHS组的P16、P21和P53蛋白表达各降低了197.5%、198.4%、395.1%（P﹤0.01）。结果显示:H2S具有拮抗H2O2诱导的血管平滑肌细胞衰老的作用。3.将细胞随机分为3组,即对照组、H2O2组及NaHS+H2O2组。然后应用Western blotting检测相关蛋白:P16、P21、P53。与对照组相比,H2O2组的Klotho蛋白表达下降了10.6%（P﹤0.01）。与H2O2组比较,NaHS+H2O2组的Klotho蛋白表达增加了43.1%（P﹤0.01）。和对照组比较,H2O2组的p-FoxO1蛋白表达增加了7.4%（P﹤0.01）。与H2O2组比较,NaHS+H2O2组的p-FoxO1蛋白表达减少了30.2%（P﹤0.01）。说明H2S抗血管平滑肌细胞衰老过程中,Klotho蛋白的表达上调,磷酸化FoxO1的表达下调。4.将细胞随机分为4组,对照组、H2O2组、H2O2+NaHS组、H2O2+NaHS+FoxO1 siRNA组。对照组相比,H2O2组β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率增加了272.7%（P﹤0.01）。H2O2+NaHS组与H2O2组相比,阳性细胞率减少了65.5%（P﹤0.01）。H2O2+Na HS+FoxO1siRNA组与H2O2+NaHS组相比,阳性细胞率增加了166.7%（P﹤0.01）。H2O2组与对照组相比,P16、P21、P53蛋白表达分别增加了51.1%、76.6%、25.1%（P﹤0.01）。H2O2+NaHS组与H2O2组相比,P16、P21、P53蛋白表达分别减少了41.2%、45.8%、52.2%（P﹤0.01）。H2O2+NaHS+FoxO1 siRNA组与H2O2+NaHS组相比,P16、P21、P53蛋白表达分别增加了45.1%、48.9%、49.2%（P﹤0.01）。说明FoxO1为H2S抗血管平滑肌细胞衰老过程中的一个靶点。沉默FoxO1将削弱H2S抗血管平滑肌细胞衰老的作用。5.将细胞随机分为4组,对照组、H2O2组、H2O2+NaHS组、H2O2+Na HS+Klotho siRNA。与对照组相比,H2O2组β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率增加了166.7%（P﹤0.01）。H2O2+NaHS组与H2O2组相比,阳性细胞率减少了75.1%（P﹤0.01）。H2O2+Na HS+Klotho siRNA组与H2O2+NaHS组相比,阳性细胞率增加了310.2%（P﹤0.01）。H2O2组与对照组相比,P16、P21、P53蛋白表达分别增加了33.8%、82.4%、45.5%（P﹤0.01）。H2O2+NaHS组与H2O2组相比,P16、P21、P53蛋白表达分别减少了39.4%、43.5%、25.2%（P﹤0.01）。H2O2+NaHS+Klotho siRNA组与H2O2+NaHS组相比,P16、P21、P53蛋白表达分别增加了30.5%、57.1%、50.7%（P﹤0.01）。结果表明,沉默Klotho显著削弱H2S抗血管平滑肌细胞衰老的作用。结论:H2S可抑制H2O2诱导的血管平滑肌细胞衰老。其机制与上调Klotho的表达,降低Fox O1磷酸化水平,增强FoxO1的活性有关。