庚型肝炎病毒（HGV）和输血传播性病毒（TTV）是分别于 1995和 1997年鉴定的新型肝炎相关病毒。HGV为黄病毒家族中的单正链RNA病毒，全长约9．4Kb，从5′到3′依次编码5′－NCR、C、E1、E2、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B和3′-NCR。C区和 E区编码核心蛋白和包膜蛋白，NS3区编码病毒超 Ⅱ组解旋酶、锌蛋白酶和丝氨酸蛋白酶，NS5B编码RNA依赖的RNA聚合酶。几年来，对于HGV的基因组结构与传播途径研究的比较清楚，但仍存在如下问题亟待解决：1．HGV的致病性：由于HGV是在非甲-戊型肝炎患者中发现的，便认为是一个新的肝炎病毒，但随后的研究对其致病性提出了争议，因此，HGV的致病性及致病机制尚未完全明确。2．HGV的组织亲嗜性：对HGV的复制部位持有两种意见，一种认为HGV具有嗜肝性，另一种认为有嗜淋巴性，多数学者倾向后一种看法。3．HGV的细胞感染模型；有研究表明HGV能够在PBMCs、有干扰素抗性的Daudi细胞（B细胞淋巴瘤细胞）、PH5CH、MT-2C中复制和表达，但仍未建立稳定传代感染的细胞模型。TTV为单负链DNA病毒，目前的研究表明TTV在感染者体内可能存在两种形状的基因组，一种是线状，一种是环状，多数研究表明为后一种。TTV虽为DNA病毒，但其基因组结构具有显著的遗传学多样性，可导致不同的变异株，不同变异株导致疾病产生的能力也不同。本研究分别对HGV和TTV进行了一些基础研究。 第一部分庚型肝炎病毒（HGV）的研究 本教研室曾经构建了HGV全基因组cDNA克隆pHGVqz，并在GenBank注册 （注册号为AF081782）。为了进一步阐明HGV的致病性和复制部位，本研究在获得HGV全基因组 cDNA克隆的基础上，体外转录获得了全长 HGVRNA基因组，研究了该RNA转录体对恒河猴的致病性，并初步建立了HGV感染的细胞模型，主要工作如下。1、HGVRNA转录体感染恒河猴的研究 以HGV全长cDNA基因组克隆为模板，体外转录制备了全长HGV RNA转录体，肝内注射感染BK15和BY1两只恒河猴，取其感染后阳性血清分别感染BS1和BM1恒河猴，然后取BM1阳性血清再感染BB1恒河猴。 感染后每周或隔周抽血检测血清 ALT水平、HGV RNA和抗-HGV。除 BS1外，其它实验猴血清ALT均出现不同程度的升高，但存在个体差异。BK15和BY1分别于感染后第1周和第 8周血清 HGV RNA阳转，且持续存在达 27周之久，其余 3只传代感染的恒河猴血清 HGV RNA也均阳转。在五只实验猴血清中均检测到了抗-HGV。定期手术取肝组织检测组织病理变化及 HGV E2蛋白在肝细胞中的表达，所第二军医大学博士学位论文 中文摘要有实验猴肝组织病理检查均呈现轻度肝炎样变。以MAb做免疫组化检测的结果表明，HGV EZ蛋白主要在肝细胞浆中表达，在心脏和脾脏细胞中亦有不同程度的表达，但存在个体差异。在BK15、BYI和 BMI肝组织中检测到了 InRNA的表达。透射电镜观察BK15实验猴肝细胞，发现两种病毒样颗粒，一种呈晶格状排列，直径约25－30urn；一种呈圆团状存在，直径约67urn。 以 HGV特异性的荧光标记探针定量检测 BKIS血清 HGV ILNA的动态变化，验证了血清HGV定性分析结果。定量检测了BK15和BSI的心、肝、胰、肾及BYI、BMI、BBI活检肝组织中HGV正、负链RNA，在除BSI之外的其它实验猴肝组织内均检测到了HGV正、负链RNA的存在，表明HGV能够在肝组织中复制。在BK15猴的心、肝和脾脏细胞中均检测到了HGV的复制，说明在该实验猴体内可能存在嗜肝性和嗜淋巴性双重亲嗜性HGV。而在BSI肝组织末检测到HGV的复制，却在脾脏中检测到高水平的HGV复制，在此猴体可能仅有淋巴亲嗜性HGV株。 结论：恒河猴对HGV敏感，可作为实验动物模型。HGV可在恒河猴中传代感染并引起轻度的肝炎样病变。HGV可以在恒河猴肝组织复制，亦可在心脏和脾脏中复制。2、RGV细胞模型的初步建立 利用LipofeCtamin将HGV RNA转录体转染HepGZ细胞，RTICR检测培养细胞和上清中HGV正、负链NA，在转染后24h便可在培养上清中检测到HGV负链RNA。以此上清感染新鲜HepGZ细胞，每36天传代一次，共传代20余次，细胞至少能够存活90天。传代细胞及培养上清中均可检测到HGV正、负链NA。制备细胞爬片，免疫组化检测到 HGV EZ蛋白在细胞中的表达。SDS．PAG和 Westemblot亦检测到 HGV EZ蛋白在感染细胞中的表达。 取HGV RNA阳性培养上清感染新鲜HepGZ细胞，上清中检测到负链RNA时再感染新鲜细胞，共传代感染一次，传代感染的细胞中均可检测到HGV的复制。 HGV感染的HePGZ细胞经冻存后再复苏，在培养上清和细胞内仍能检测到HGVRNA。 结论：＊印GZ细胞不仅对HGV易感，而且可以支持HGV的复制增殖。3、HGV NSS基因在昆虫细胞中的表达与鉴定 以 pHGVIwh6重组质粒为模板，PCR扩增 HGV NSS部分基因片段，BalnHI和Kpn酶切后定向克隆至pPROEX HTa载体进行序列测定。将正确的基因片段克隆至转座载体 pFastBac HTa，获得重组转座质粒 pFHTNSS。转化含有 bacmid和辅助质粒的D