研究背景和目的： 结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的严重威胁人类健康的以呼吸系统为主的细菌感染性疾病。随着卡介苗(M.boris Bacille Calmette-Guerin，BCG)的问世和普遍接种，结核病的发病曾一度呈下降趋势。这几年，由于卡介苗不能使机体获得终生免疫而阻止感染，发病及扩散，艾滋病的感染和结核杆菌耐药性的增加，结核的发病率持续增长。全世界约三分之一人口(约20亿)感染了MTB，现有结核病人2000万，每年新发病人约900万，死亡人数高达200～300万。 MTB是一种胞内致病菌，它通过一系列复杂的机制寄生于巨噬细胞并进而侵犯免疫系统。MTB通常首先在肺泡、肺泡管、淋巴结的巨噬细胞内繁殖，这些巨噬细胞最终被杀死逐渐形成结节，通过一系列的胞内免疫反应导致干酪样坏死。MTB可扩散到身体的其他部位，比如肝、脾、脑、骨、肾和淋巴结。在这些部位，可以形成显性的感染源，但更多的是MTB潜伏下来。所以感染MTB不一定会发病。90％的感染者中，细菌会在人体内潜伏，免疫力的下降会引起病原体的复活而发病，并通过痰液和咳嗽由空气传播。 现有的临床实验诊断方法包括以结核菌素(PPD)试验检测MTB感染者的迟发型超敏反应、痰涂片抗酸染色寻找MTB、MTB的分离培养、血清抗体检测及核酸成分检测等。PPD试验容易出现假阳性和假阴性结果。艾滋病合并结核时PPD试验常常为阴性，出现典型结核的临床表现时病人一般已经进入终末期。细菌培养的时间长，而且10％～20％的病例中，MTB不能被成功培养。显微镜检查痰液的敏感性低，在西方国家只有40％～50％的病例能得到阳性结果。PCR方法会高频率的出现假阳性结果。抗体检测虽然能作为诊断方法之一，但结核病免疫主要是细胞免疫，抗体并不能清除MTB，这些方法并不能反映结核病人全身和局部组织免疫状况，因此，为解决现有的临床实验诊断方法和卡介苗的局限性，研究灵敏度高，特异性好，能检测结核和艾滋病相关结核病人全身和局部组织免疫状况的新型临床试验诊断方法以及发展有效的新型结核疫苗也是非常必要的。 四聚体技术是一种可以直接对抗原特异性T淋巴细胞进行标记的新方法。T淋巴细胞的特异性是由T细胞受体(T cell receptor，TCR)决定的。TCR通过识别抗原提呈细胞表面的MHC-肽复合物，并在一系列共刺激分子的作用下，介导T细胞活化，即细胞增殖和分泌细胞因子，所以可以考虑根据TCR与MHC-肽的特异性相互作用，来检测抗原特异的T细胞。尽管MHC-肽单体能与TCR结合，但其亲合力很低，解离速度很快，因此MHC-肽单体不能用于检测抗原特异的T细胞。文献报道，通过将单体多聚化可提高相互作用的分子间的亲合力，从而降低解离速度。多聚体形式的MHC-肽复合物可与同一细胞表面的多个TCR结合，因此可以提高两者间的亲合力。1996年，可用于对抗原特异的T细胞进行标记的MHC Class I-肽四聚体被制备成功，并得到应用。四聚体技术通过生物素．亲和素的作用，将四个MHC-肽复合物连成一个四聚体。MHC I四聚体首先被制备出，1998年，MHC ClassⅡ-肽复合体的荧光多聚体由Crawford等制备出。随后多种MHC分子，如HLA2、A11、A28、B8、B27、B35、E1、G1、DR、DQ和CD1d分子的四聚体被制备成功[34]，并被用于研究抗原特异的CD4+T辅助细胞、CD8+的T杀伤细胞和NK细胞在多种免疫应答中的作用。四聚体技术与常规的检测抗原特异的T细胞的方法相比，其显著优点是直接、灵敏和迅速。可溶性的四聚体与分离的淋巴细胞孵育后，即可用流式细胞仪进行检测。四聚体检测方法还能与细胞表面和胞内的其他标记分子相结合，从而对抗原特异的T细胞进行多种分析：如细胞的分化状态、共刺激分子和整合素分子的表达情况。 MHC class Ⅰ和class Ⅱ四聚体已经被用来深入研究定量和发现抗原特异性T细胞，并且用来探索TCR与MHC之间的相互作用。但是目前未有实验室做过利用结核特异性的TCR α链和β链构建的四聚体来分析结核特异性多肽-MHC复合体。我们在实验中以表达纯化的TCR α／β双链单体与链霉亲和素-PE按8：1比例初步制备成四聚体。但众多的α链与β链的分别配对组合是否适合并未可知，因此进一步则用初步制备的上述四聚体分别对本课题组已经构建的MTB多肽／HLA Class Ⅱ(DR)等位基因细胞膜表达S2细胞株染色，用流式细胞仪分析，进行α／βTCR最佳配对四聚体筛选。 当我们用这个筛选出的特异性TCR四聚体检测病人的血液或者胸水时，如果其中含有细胞膜表面带有结核特异性的多肽-HLA DR复合体的抗原递呈细胞(Antigen presenting cells，APC)及其它相关细胞如靶细胞等，那么通过流式细胞仪就能被构建好的TCR四聚体识别。因此，构建好的TCR四聚体或许可对结核的实验诊断和致病与免疫机制研究提供一个很好的工具。 研究内容和方法: 1.实验中利用从结核患者胸水(PLF)已经克隆出的CD4+TCR α链和β链重组克隆质粒共32个，分别将其跨膜区和细胞内片段切除，末端与实验室已有的含极性氨基酸序列(F,J)和亲生物素片段(B)的pGEM-7zf(+)克隆质粒连接，制备成重组亚克隆质粒TCRα—FB—pGEM-7zf(+)，TCRβ—JB—pGEM-7zf(+)。加上互补的极性氨基酸片断(F，J)是使α，β链被S2细胞表达之后可以形成互补的二聚体，加上亲生物素片断的目的是α，β链被S2细胞表达之后可以标记上生物素，两对α、β形成的二聚体经过纯化后可以通过亲和素或链霉亲和素结合，从而形成α/βTCR四聚体。 2.选择共同CDR3区或基序较多的TCR α链和β链分别再次亚克隆入表达载体pMT/V5-His。pMT／V5-His为真核表达载体，带有金属启动子、多克隆位点、V5和6×His标签。分别酶切FCRα—FB—pGEM-7zf(+)，TCRβ—JB-pGEM-7zf(+)，载体pMT/V5-His，将酶切片段连入酶切后的载体pMT／V5-His，连接后，转化入大肠杆菌DHSα感受态细胞，挑取阳性克隆，经菌液PCR，酶切鉴定后，提取重组质粒TCRα—FB—pMT/V5-His，TCRβ—JB—pMT/V5-His。 3.中量提取TCRα—FB—pMT/V5-His，TCRβ—JB—pMT/V5-His质粒，测定其浓度，并将同一病人TCRα—JB—pMT/V5-His，TCRβ—JB—pMT/V5-His质粒与生物素化酶重组质粒(BirA)，潮霉素筛选质粒(pCohygro)用磷酸钙法共转染入果蝇胚胎细胞巨噬细胞株(Drosophila Schneider 2 Cells，S2)经过潮霉素筛选一个月后，获得了稳定表达的TCRα／β双链单体、生物素化酶、潮霉素抗性共表达的恒定细胞株共6株。用CuSO4诱导，并加入生物素，取细胞上清经免疫斑点杂交(Dot—blotting)、Western—blotting、SDS-PAGE分析，检测抗V5抗体鉴定目的蛋白表达和生物素化情况。 研究结果: 1.在TCR α和β链跨膜区一端加上极性氨基酸片段和亲生物素片段，得到TCRα链亚克隆为19个，TCRβ链亚克隆为13个。根据获得的TCR α和β，查到有相同的CDR3区或者基序较多的TCR α和β链，并将其成功亚克隆入表达载体pMT/V5-His，获得了3个TCRα链亚克隆表达质粒和5个TCRβ链亚克隆表达质粒。 2.转染入pMT/V5-His的同一病人的TCRα和β链共6对，成功转染至S2细胞，并获得稳定的细胞株。用SDS-PAGE可以观察到在33KD、35KD、39KD处有三条带，分别是TCRα、BirA酶、TCRβ。在用抗V5抗体进行western-blotting后，观察到在33KD、39KD处分别有两条带，说明TCRα和TCRβ成功转染至S2细胞。转染后用Dot-blotting方法可以观察到在加入生物素后，用碱性磷酸酶标记的链霉亲和素孵育后，发现TCR α和β链已标记上生物素。 结论： 获得了连接亲水性极性氨基酸片段和亲生物素片段的TCR α链19个，TCRβ链13个。获得能表达CD4+TCRα和β链及其双链单体的恒定的果蝇S2细胞株6株，为进一步进行CD4+TCR双链单体的大量表达和纯化，进而制备成四聚体建立了基础。