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目的:支气管哮喘的发病机制非常复杂,涉及到遗传、环境、行为、心理、机体免疫等诸多方面,虽然世界各国对支气管哮喘的发病及防治作了大量的研究,但其发病机制至今尚未完全阐明。目前认为细胞凋亡与支气管哮喘发病相关。Bcl-2基因是人们近年来广泛重视并研究的一种原癌基因,这是一种凋亡抑制基因,可抑制多种细胞凋亡,不仅在细胞凋亡的分子调节中起着重要的作用,而且与多种疾病的发生发展存在密切的关系。目前国内外对Bcl-2基因与肿瘤的关系研究较多,而与支气管哮喘的相关性研究报道不多。本研究测定支气管哮喘患者外周血白细胞Bcl-2基因mRNA的表达量及其血清中蛋白的含量,从基因水平研究BCL-2在支气管哮喘中的表达及其相互关系。初步探讨Bcl-2基因在支气管哮喘的发生、发展中的生物学意义,从而为支气管哮喘新的治疗方法如基因治疗提供一定的理论依据。
方法:选取20例2004~2005年在海南省人民医院门诊就诊或住院的支气管哮喘中重度发作患者为实验组,20例无支气管哮喘、变态反应性疾病的健康人为对照组。采取抗凝静脉血标本5ml,立即用Dextron-PBS分离出血白细胞,采用TristarTM试剂按试剂盒说明提取总RNA,-80°超低温冰箱保存,采用TaKaRa试剂盒检测Bcl-2基因mRNA表达量。
两步法:第一步:用ExScriptTM反转录酶,对BCL-2mRNA反转录成cDNA;第二步:用PremixExTaqTM酶对反转录后的cDNA进行扩增,10倍梯度稀释cDNA模板,分别为100、10-1、10-2、10-3、10-4倍梯度,BCL-2基因引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成上游引物:5’-GGTGCCACCTGTGGTCCACCT-3,下游引物:5’-CTTCACTTGTGGCCCAGATAGG-3’,用美国PE公司5700型实时荧光定量PCR仪进行检测,以GAPDH基因为对照基因,用仪器附带SDS软件自动算出Bcl-2基因与对照基因比值,确定Bcl-2基因的相对含量。同时抽取抗凝静脉血2ml,伊红染色,光学显微镜下外周血嗜酸性粒细胞计数。抽取不抗凝静脉血2ml,分离血清,采用澳大利亚BenderMedsystems公司人Bcl-2蛋白检测试剂盒,按试剂盒说明操作,通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测Bcl-2蛋白含量。应用SAS6.12计算机软件对实验结果进行统计学分析。
结果:支气管哮喘患者外周血嗜酸性粒细胞计数较正常对照组比较有非常显著性增加(P<0.01),20例支气管哮喘患者外周血细胞Bcl-2基因mRNA表达量高于正常对照组,两组有非常显著性差异(P<0.01),外周血清Bcl-2蛋白含量与正常对照组差异无显著性(P>0.01)。
结论:支气管哮喘是以外周血嗜酸性粒细胞计数增高,气道嗜酸性粒细胞浸润为特征的慢性炎症。本研究证实支气管哮喘患者外周血嗜酸性粒细胞显著增多。支气管哮喘患者外周血细胞Bcl-2基因mRNA表达显著增多,揭示Bcl-2基因在支气管哮喘发病中具有一定的作用和意义,Bcl-2基因与支气管哮喘密切相关。而外周血清中Bcl-2蛋白含量与支气管哮喘的发病无直接相关。