Viperin是一种干扰素诱导蛋白,可通过完全不同的机制对多种病毒发挥抗病毒活性。先前的研究没有viperin抑制狂犬病病毒(RABV)复制的报道。通常狂犬病病毒在其易感细胞中生长良好,具有较高的病毒滴度。最近我们的研究中发现,狂犬病病毒在巨噬细胞RAW264.7中生长缓慢,病毒滴度显著地低于易感细胞(如NA细胞)。进一步的研究发现,狂犬病病毒感染易感的NA细胞时,viperin表达微弱或不表达,但感染巨噬细胞时viperin被显著诱导表达。本研究为了探索抗病毒蛋白viperin的表达是否抑制狂犬病病毒的复制,我们构建了viperin的真核表达载体,通过瞬时转染BSR-T7细胞,过表达viperin,证实了过表达viperin能抑制狂犬病病毒rRC-HL的复制,在一定范围内狂犬病病毒N、P和M蛋白在细胞中的表达量明显被抑制,狂犬病病毒滴度显著降低。通过筛选稳定表达viperin的BHK-21细胞系,感染狂犬病病毒,发现稳定表达viperin的BHK-21细胞系对狂犬病病毒rRC-HL株的抑制效果更加明显,显著抑制了病毒蛋白的合成。同样稳定表达viperin的BHK-21细胞系显著抑制广西分离强毒Ⅰ群和Ⅲ群代表株GX01和GXN119。在此基础上,为了进一步探索viperin抑制狂犬病病毒主要功能区域,本实验构建了缺失viperin N末端两亲性的a螺旋区域及突变S-腺苷甲硫胺酸酶基序的突变体,测定这些突变体抑制狂犬病病毒的效果,结果显示viperin的抑制狂犬病病毒复制活性区域主要位于其N末端,其突变后抗狂犬病病毒能力显著下降。S-腺苷甲硫胺酸酶基序的3个关键氨基酸(C83A/C87A/C90A)突变后,其抑制狂犬病病毒的能力也明显下降。先前的研究发现viperin的N末端可结合细胞的内质网及脂滴,扰乱细胞膜的脂筏结构来抑制病毒的出芽与释放。为了探索viperin抑制狂犬病病毒复制的机理,本实验就viperin对脂筏的重要组成成分胆固醇和鞘磷脂的生物学作用进行探索。首先在BSR-T7细胞中过表达viperin,检测细胞中胆固醇和鞘磷脂变化情况。结果显示,过表达viperin能够降低细胞中胆固醇和鞘磷脂的含量,推测viperin可能通过破坏胆固醇和鞘磷脂以抑制狂犬病病毒释放。同时添加分别抑制胆固醇和鞘磷脂的药物MβCD和Myroicin,发现破坏细胞的胆固醇和鞘磷脂对狂犬病病毒的吸附与穿入无影响,但对狂犬病病毒的出芽与释放有抑制作用,证实了破坏细胞的胆固醇和鞘磷脂是viperin抑制狂犬病病毒复制的重要途径之一。Viperin是干扰素诱导蛋白,受干扰素的诱导和调控,本实验进一步探索狂犬病病毒感染巨噬细胞上调viperin基因的上游信号传导通路,应用芯片技术对狂犬病病毒感染RAW264.7细胞后,84个免疫应答基因及几个主要看家基因转录谱进行了分析。结果显示,狂犬病病毒感染巨噬细胞后12、24和36 h三个时间点都上调2倍以上的基因共有26个；12 h上调2倍以上、24和36 h无明显变化的基因有2个；12和24 h上调2倍以上、36 h无明显变化的基因有1个；12h无变化、24和36 h上调2倍以上的基因有15个；12和24 h无变化、36 h上调2倍以上的基因有17个；12、24和36 h三个时间点都没有明显变化(小于2倍)的基因有25个；12、24和36 h三个时间点都下调2倍以上的基因有1个。其中,Cxcl10基因在12、24和36 h三个时间点上调倍数分别为377.85、333.14和183.12倍；IFNβ基因分别为370.07、68.12和13.09倍。狂犬病病毒感染RAW264.7细胞也会引起TLRs不同程度升高,TLR3基因分别为156.68、380.03和164.66倍,TLR2和TLR8基因呈一定程度的上调表达,TLR1、TLR4、TLR5、 TLR6、TLR7和TLR9也有较显著的变化。上述实验证明TLRs参与了狂犬病病毒感染RAW264.7细胞的免疫信号传导。根据TLR4能够识别病毒的囊膜蛋白传递免疫信号和激活机体固有免疫、TLR3识别双链RNA (dsRNA)和病毒复制过程中产生的中间复合物的特性,本研究使用流式细胞术证明了巨噬细胞感染狂犬病病毒后,显著上调TLR4的表达,说明狂犬病病毒激活了TLR4然而再用灭活的狂犬病病毒孵育巨噬细胞,发现保留了基本自然特性的狂犬病病毒囊膜糖蛋白能够诱导viperin的表达。进一步用TLR4的特异性抑制剂(TAK-242)阻断TLR4信号的传导,显示viperin的表达量显著减少,说明TLR4参与了识别狂犬病病毒并诱导viperin表达。为了验证TLR3与狂犬病病毒相互作用及其诱导viperin表达的固有免疫反应,本实验首先构建了TLR3基因敲除的TLR3-/- RAW264.7细胞系,感染狂犬病病毒,检测viperin蛋白的变化情况,显示敲除了TLR3基因的TLR3-/- RAW264.7细胞可显著推迟并减少viperin蛋白表达量,说明TLR3参与识别狂犬病病毒核酸并诱导viperin的表达。NF-κB和IRF3是固有免疫信号通路中两个重要的免疫因子,用NF-κB的特异性抑制剂抑制其通路的信号传导,然后感染狂犬病病毒,结果显示抑制NF-κB通路的信号传导,viperin的表达量几乎不受影响,说明狂犬病病毒上调viperin与NF-κB信号通路没有直接关联性。用IRF3的特异性抑制剂格尔德霉素抑制处理细胞后,可抑制IRF3的分子伴侣Hsp90,使viperin的表达时间推迟并减少表达量,说明IRF3参与了狂犬病病毒诱导viperin表达的调控。综上所述,狂犬病病毒感染巨噬细胞RAW264.7可诱导干扰素诱导蛋白viperin表达,viperin表达具有抑制狂犬病强毒、弱毒复制的作用。这种抑制作用主要通过破坏RAW264.7细胞膜的胆固醇和鞘磷脂,阻碍病毒的出芽和释放。进一步的芯片技术研究发现,巨噬细胞RAW264.7感染狂犬病病毒时多数TLRs的表达受到影响。当用狂犬病病毒感染敲除TLR3基因的TLR3-/- RAW264.7细胞,viperin的表达量比正常RAW264.7细胞显著减少并延后；用TLR4抑制剂TAK-242可抑制狂犬病病毒诱导viperin的产生；因此,viperin的诱导受上游TLR3/TLR4的调控。通过系统研究,阐明了狂犬病病毒感染巨噬细胞RAW264.7诱导viperin的分子通路,具有重要的理论价值和实践意义。