自201010月份以来，由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)变异株导致的以哺乳仔猪呕吐、腹泻、脱水和急性死亡为特征的猪流行性腹泻(porcineepidemic diarrhea，PED)在中国大面积暴发流行。本次流行对2周龄以内仔猪危害尤为严重，发病率几乎100％，死亡率高达90％以上。2013年7月，PED在美国首次暴发并迅速蔓延到全美国和北美几个国家，给我国及世界养猪业造成了巨大经济损失。而传统疫苗株CV777制备的疫苗不能对被免疫猪群提供足够免疫力对抗PEDV变异株的感染。因此，急需研制一种能够针对PEDV中国变异株的新型高效疫苗。　　以猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)为载体制备基因工程苗是目前病毒载体基因工程苗研究的一大热点。本研究综合考虑了猪伪狂犬病弱毒活疫苗首免日龄为出生后3日内和PEDV感染主要对10日龄以内仔猪造成严重危害，以及这两种疫病常常混合感染等多方面的因素，首次将PEDV中国变异株S基因插入至PRV Bartha-K61疫苗株基因组中，构建出了能够表达PEDV中国变异株S蛋白的重组伪狂犬病毒，以期为更有效防控猪伪狂犬病和猪流行性腹泻提供辅助工具。　　1.表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)重组伪狂犬病毒的构建　　本研究从PRV Bartha-K61毒株的基因组中扩增TK基因上游与下游的两段特异性DNA片段，将其克隆至pMD18-T载体中获得重组质粒pTK，随后将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因表达盒插入重组质粒pTK中获得了穿梭载体pTK-EGFP。将穿梭载体转染至PRVBartha-K61毒株感染的Vero细胞，经同源重组使EGFP表达盒代替PRV基因组中的TK基因而获得能够表达绿色荧光蛋白的重组PRV。所构建重组病毒能够高效表达绿色荧光蛋白，且重组病毒的复制动态与PRV Bartha-K61株的复制动态一致，为后期利用TK基因作为插入位点构建表达PEDV中国变异株S蛋白重组伪狂犬病毒提供了实验依据。　　2.伐昔洛韦筛选TK-重组伪狂犬病病毒方法的建立　　本研究利用抗疱疹病毒药物伐昔洛韦在病毒胸苷激酶参与下，抑制疱疹病毒的复制的特性，尝试建立一种利用伐昔洛韦筛选TK-重组伪狂犬病毒的方法。研究首先通过细胞毒性实验确定了伐昔洛韦对Vero细胞的最大无毒浓度为4mg/ml，进而通过蚀斑减数实验及PRV特异性基因片段的扩增，在细胞水平和基因水平上确定了能够完全抑制100TCID50PRV Bartha-K61复制的伐昔洛韦最低有效浓度为3mg/ml;将前期构建成功的TK-重组病毒rPRV-EGFP在含有伐昔洛韦维持液的Vero细胞中培养，结果显示伐昔洛韦不能抑制重组病毒rPRV-EGFP的复制，且对重组病毒表达的荧光没有影响，表明伐昔洛韦可以作为筛选药物快速筛选TK-重组PRV。该方法的建立为后期构建表达PEDV中国变异株S蛋白的重组伪狂犬病毒的筛选提供了有力工具。　　3.伐昔洛韦在小鼠体内抑制伪狂犬病病毒野毒复制的研究　　本研究在建立快速筛选TK-重组伪狂犬病毒方法时，证明伐昔洛韦能够抑制TK-病毒在体外的复制，此部分更进一步研究了伐昔洛韦体内抗猪伪狂犬病野毒作用。用1个LD50的PRV野毒对小鼠进行攻毒，在攻毒后48h给服不同剂量的伐昔洛韦，确定了伐昔洛韦能够为小鼠提供完全保护的最低剂量为3mg/只。PRV攻毒后，未给服伐昔洛韦组小鼠表现典型的神经症状并全部死亡，而给药组小鼠临床健康并全部存活。与给药组小鼠相比，未给药组小鼠脑、肺组织中的PRV病毒载量明显高于给药组小鼠，且随时间延长而增加。脑、肺组织呈现PRV感染的特征性病理变化。伐昔洛韦给药组小鼠相应组织中的病毒载量和脾脏T淋巴细胞分泌PRV特异性Th1型细胞因子水平在攻毒后72h逐渐降低。试验结果显示，伐昔洛韦在体内同样能够有效抑制PRV野毒的复制。由于前期的实验已经证实伐昔洛韦对TK-PRV，如TK基因缺失的PRV疫苗毒株没有抑制作用，因此，本研究也为利用TK基因缺失疫苗防控PR提供辅助措施。　　4.表达PEDV中国变异株S蛋白重组伪狂犬病毒的构建　　构建含有PEDV变异株S1基因表达盒的穿梭载体，将穿梭载体转染Vero细胞，通过同源重组和伐昔洛韦快速筛选，最终获得表达PEDV中国变异株S蛋白的重组PRV。Western blot能够成功检测到PEDV S蛋白的表达。表达PEDV中国变异株S蛋白重组伪狂犬病毒的成功构建，为研制一种能够针对PEDV中国变异株的新型高效的疫苗奠定了基础。