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研究目的1探索三七总皂苷对MCAO大鼠术后7天的神经保护作用和对Lingo-1及EGFR/PI3K/AKT信号通路的调节作用。2探索三七总皂苷对SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤的保护作用和对Lingo-1及EGFR/PI3K/AKT信号通路的调节作用。研究方法1动物实验部分实验一:将大鼠随机分为假手术组和手术组。手术组采用改良Longa方法,制备大鼠大脑中动脉局灶梗死模型,约术后2h,进行EZ Longa评分,1-3分纳入,0分和4分剔除。将纳入大鼠随机分为模型组、PNS大剂量组、PNS小剂量组、尼莫地平组。假手术组大鼠仅切开颈正中皮肤,暴露颈总动脉、颈内动脉与颈外动脉,然后缝合皮肤。按照大鼠与人的体表面积等效剂量折算,给药剂量及给药方式为:PNS大剂量组为每日7.2mg/100g腹腔注射;PNS小剂量组每日3.6mg/100g腹腔注射;尼莫地平组每日1.44mg/100g灌胃;假手术组和模型组每日分别生理盐水1mL/100g腹腔注射。术后1-7天,每天进行大鼠神经功能评分,计算体重指数。实验二:通过Western Blot法检测梗死侧皮质SYN和PSD95蛋白表达量,探索PNS的神经保护作用。实验三:通过实时荧光PCR、免疫组化、Western Blot方法进一步探究三七总皂苷对MCAO大鼠术后7天大脑梗死侧皮质中Lingo-1及EGFR/PI3K/AKT信号通路的影响。2细胞实验部分实验四:SH-SY5Y细胞培养及缺氧时间摸索、药物浓度摸索。通过CCK8检测细胞存活率的方法确定细胞缺氧缺糖时间和PNS浓度。设置分组:正常组、模型组、PNS组、PNS+AG1478组、AG1478组。按照分组给予相应的药物处理和缺氧处理,CCK8法检测细胞存活率、AnnexinV-FITC/PI双染法测凋亡、微板法测定乳酸脱氢酶活性。实验五:通过实时荧光PCR方法和Western Blot方法探索三七总皂苷对缺氧缺糖SH-SY5Y细胞中Lingo-1及EGFR/PI3K/AKT信号通路的影响。研究结果1动物实验部分实验一:TTC染色:模型组大鼠大脑切片右侧可见连续白色梗死区,结果显示造模成功。体重指数评价:术后1天,假手术组大鼠体重指数略有升高,各手术组大鼠体重指数下降明显,模型组与假手术组相比,下降明显(P<0.01);术后第2、3天,各手术组大鼠体重指数持续下降;术后第4天,PNS小剂量组(P<0.05)、PNS大剂量组(P<0.01)、尼莫地平组(P<0.01)体重指数明显高于模型组,结果有统计学差异;术后第6天,PNS小剂量组体重指数与模型组相比具有显著差异(P<0.01);术后第7天,PNS大剂量组大鼠体重指数开始止降回升。mNSS神经功能评分评价:假手术组在1-7天内,没有出现神经功能缺失症状。术后1天,手术组大鼠均出现严重的神经功能缺失症状;术后1-3天,各手术组大鼠mNSS神经功能评分逐渐下降,用药各组与模型组相比未见差异(P>0.05);术后第4天,尼莫地平组(P<0.05)、PNS大剂量组(P<0.01)评分明显低于模型组;术后第5天,PNS小剂量组评分开始低于模型组(P<0.05);尼莫地平组评分明显低于模型组(P<0.01)。实验二:SD大鼠脑梗死7天,梗死侧皮质中SYN和PSD95蛋白表达量均明显下降;PNS小剂量组、PNS大剂量组、尼莫地平组大鼠梗死侧皮质SYN、PSD95蛋白表达量明显高于模型组,具有统计学差异(P<0.01)。实验三:qRT-PCR检测MCAO大鼠7天后梗死侧皮质Lingo-1、EGFR、PI3K、AKT mRNA的表达:SD大鼠MCAO术后7天,模型组大鼠Lingo-1的mRNA表达量明显高于假手术组,有统计学差异(P<0.01);PNS小剂量组、PNS大剂量组、尼莫地平组Lingo-1 mRNA的表达量较模型组显著下降,有统计学差异(P<0.01);SD大鼠MCAO术后7天,各手术组大鼠EGFR、PI3K、AKT mRNA表达量略有升高,但无统计学差异(P>0.05)。Western Blot 法检测 MCAO 大鼠脑组织中 Lingo-1 及 p-EGFR/EGFR、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白的表达:SD大鼠MCAO术后7天,与假手术组相比,模型组Lingo-1蛋白表达明显升高,具有统计学差异(P<0.01);PNS小剂量组、PNS大剂量组、尼莫地平组Lingo-1蛋白表达较模型组明显降低。SD大鼠MCAO术后7天,模型组p-EGFR/EGFR蛋白比值与假手术组比明显升高,具有统计学差异(P<0.01);PNS小剂量组、PNS大剂量组、尼莫地平组p-EGFR/EGFR蛋白比值较模型组明显升高;PNS大剂量组、尼莫地平组p-EGFR/EGFR蛋白表比值均值大于PNS小剂量组。SD大鼠MCAO术后7天,模型组p-PI3K/PI3K蛋白比值与假手术组相比明显升高(P<0.01);PNS小剂量组、PNS大剂量组、尼莫地平组p-PI3K/PI3K蛋白比值较模型组明显升高;PNS大剂量组、尼莫地平组p-PI3K/PI3K蛋白比值均值大于PNS小剂量组。SD大鼠MCAO术后7天,模型组p-AKT/AKT蛋白比值与假手术组相比明显升高(P<0.01);PNS小剂量组、PNS大剂量组、尼莫地平组p-AKT/AKT蛋白比值较模型组明显升高;PNS大剂量组、尼莫地平组p-AKT/AKT蛋白比值均值大于PNS小剂量组。免疫组化法测MCAO大鼠术后7天脑组织中Lingo-1、p-EGFR、p-AKT、p-PI3K的表达:免疫阳性物质被染成深棕色颗粒,结果与Western Blot趋势一致。2细胞实验部分实验四:选取16h作为最佳缺氧时间,既可以造成缺氧缺糖损伤,又可以保证大部分细胞的存活率。采用PNS浓度为640mg/L为造模药物浓度,此时细胞存活率最高。设置实验分组:正常组、模型组、PNS组、PNS+AG1478组、AG1478组。CCK8结果:缺氧缺糖损伤对SH-SY5Y细胞造成了严重的损伤,PNS可提高存活率,与模型组相比,有统计学差异(P<0.01)。当PNS组细胞加入AG1478后,PNS的保护作用减弱。单用AG1478时,与模型组相比,细胞存活率显著降低(P<0.01)。PNS对SH-SY5Y细胞缺氧缺糖处理后细胞凋亡的影响:SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤后,凋亡率明显升高。PNS可明显降低细胞的凋亡率(P<0.01)。当PNS组细胞培养基中加入AG1478后,明显抑制PNS的抗凋亡作用。LDH活性检测结果:缺氧缺糖损伤对SH-SY5Y细胞造成了严重的损伤,使培养基中LDH活性明显增高(P<0.01)。PNS可有效保护SH-SY5Y细胞,降低LDH活性,与模型组相比,有统计学差异(P<0.01)。AG1478可减弱PNS对的保护作用。AG1478组与模型组相比,LDH活性明显增高,结果有统计学差异(P<0.01)。实验五:三七总皂苷对SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤Lingo-1及EGFR/PI3K/AKT mRNA表达的影响:SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤后,与正常组组相比,模型组Lingo-1 mRNA 表达明显升高(P<0.01);PNS 组和 PNS+AG1478 组 SH-SY5Y细胞 Lingo-1 mRNA表达水平较模型组明显降低(P<0.01)。AG1478组Lingo-1 mRNA表达与模型组无差异。SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤后,正常组、PNS组、PNS+AG1478组、AG1478组细胞EGFR、PI3K、AKTmRNA的表达与模型组之间无差异。三七总皂苷对SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤Lingo-1及p-EGFR/EGFR、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达的影响:SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤后,模型组Lingo-1蛋白的表达与正常组相比明显升高(P<0.01);PNS组SH-SY5Y细胞Lingo-1蛋白表达水平较模型组明显降低(P<0.01);PNS+AG1478组SH-SY5Y细胞Lingo-1蛋白表达水平较模型组降低,具有统计学差异(P<0.05);AG1478组Lingo-1蛋白表达与模型组无差异。SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤后,模型组p-EGFR蛋白与EGFR总蛋白比值与正常组相比明显升高,具有统计学差异(P<0.01);PNS组p-EGFR蛋白与EGFR总蛋白比值与模型组相比,比值升高明显,具有统计学差异(P<0.01);PNS+AG1478组p-EGFR蛋白与EGFR总蛋白比值与模型组无差异(P>0.05);AG1478组p-EGFR蛋白与EGFR总蛋白比值与模型组相比,比值降低明显(P<0.01)。SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤后,模型组p-PI3K蛋白与PI3K总蛋白比值与正常组相比明显升高,有统计学差异(P<0.01);PNS组p-PI3K蛋白与PI3K总蛋白比值与模型组相比明显升高,有统计学差异(P<0.01);PNS+AG1478组和AG1478组p-PI3K蛋白与PI3K总蛋白比值与模型组相比无统计学差异(P>0.05)。SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤后,模型组p-AKT蛋白与AKT总蛋白比值与正常组相比明显升高(P<0.01);PNS组p-AKT蛋白与AKT总蛋白比值与模型组相比明显升高(P<0.05);PNS+AG1478组p-AKT蛋白与AKT总蛋白比值与模型组相比无统计学差异(P>0.05)。AG1478组p-AKT蛋白与AKT总蛋白比值与模型组相比明显降低(P<0.01)。研究结论三七总皂苷对MCAO大鼠和缺氧缺糖SH-SY5Y细胞起到神经保护的作用:三七总皂苷可以促进MCAO大鼠体重指数的增长、神经功能的恢复,提高梗死侧皮质SYN、PSD95蛋白的表达;可以提高缺氧缺糖SH-SY5Y细胞存活率、抑制细胞凋亡、降低乳酸脱氢酶活性。三七总皂苷可以通过降低神经系统受损后Lingo-1的高表达表达及促进EGFR/PI3K/AKT信号通路的激活发挥神经保护作用。