马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi Subsp zooepidemicus,SEZ）和猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2,SS₂）是我国猪链球菌病的两种主要病原。SEZ主要引起猪的化脓性关节炎和败血症,而SS₂不仅可引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎和突然死亡,还可以感染相关人员并致死,是一种重要的人畜共患病病原。 SS₂在世界很多国家均受到重视,对它的研究主要集中在与毒力相关蛋白的研究上。溶菌酶释放蛋白（muraminidase-released protein,MRP）和胞外蛋白因子（extracellular protein factor,EPF）是SS₂两个主要的致病因子。根据MRP和EPF毒力相关蛋白的存在与否,SS₂可分为以下几种表现型:MRP⁺EF⁺、MRP^-EF^-、MRP⁺EF^*、MRP^*EF^-、MRP^-EF⁺、MRP⁺EF^-、MRP^-EF^*等。对我国江苏及其周边地区的流行病学调查显示,来自疫区的SS₂均为对猪有强毒力的MRP⁺EF⁺表现型,由此可见,MRP与EPF在致病过程中的重要作用。目前,对两毒力因子的研究仍然是国内外的一个热点,而对两毒力因子间协同作用机理的研究,报道甚少。与此同时,对该病的防制亦缺乏有效的疫苗。 本实验目的是通过DNAStar软件分析,克隆表达mrp和epf一段基因,验证该片段具有免疫原性后,通过PCR串联两片段并克隆表达,通过动物保护性试验明确串联表达的蛋白是否具有更好的保护作用,为进一步研究其结构和协同作用机理、研制亚单位疫苗提供依据。 目前,对SEZ和SS₂抗体检测方法报道甚多,但结论不一。本实验对三种抗原进行筛选,优化条件,建立检测两种猪源链球菌抗体的间接ELISA方法,并对猪免疫链球菌2价灭活苗后的抗体进行检测,找出抗体消长规律;每隔一定时间,分别以最小致死量强毒株CY与SS₂-1对猪进行攻毒,探讨CPS抗体水平与免疫保护之间的关系。并运用此方法对周边猪场的临床血清样品进行了检测。 1 猪链球菌2型MRP和EPF基因片段的克隆与串联表达 按照GenBank中的mrp、epf基因序列,利用DNAStar软件分析,选取一段基因序列,各设计一对引物,两端分别加限制性酶的酶切位点Nco Ⅰ、EcoR Ⅰ和EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ,分别构建原核表达载体pET32a-mrp、pET32a-epf,经克隆表达得