论文部分内容阅读
目的：NK细胞是固有免疫的重要组成部分，无需抗原预先致敏，即可直接杀伤肿瘤、病毒或细菌感染的靶细胞，是机体免疫防御的第一道防线，在机体免疫监视和早期抗感染免疫过程中发挥重要作用。HIV感染是目前全世界未能攻克的难题，越来越多的研究证明，NK细胞的先天免疫反应在抵抗HIV感染中发挥着重要的作用。NK细胞是一群异质性的细胞，由于CD56的发现将人类NK细胞重新划分了不同亚群，然而CD56抗原不表达在啮齿动物，且以CD56为标志的NK细胞分群不能更好地对NK细胞进行功能性分群，因此研究者们不断的探索NK细胞新的分群方法，以便于发现更好的功能性分群标志物。在2011年首次报道了应用CD11b和CD27定义人类NK细胞不同亚群和功能特异性。根据CD11b和CD27定义了人类NK细胞4个亚群，分别为CD11b-CD27+(CD27+SP)，CD11b+CD27+(DP)，CD11b-CD27-(DN)，CD11b+CD27-(CD11b+SP)，可以反映了人类NK细胞不同的亚群和功能特异性。研究报道CD11b与CD27定义的NK细胞亚群在肺癌患者中发生明显的变化，并且与肺癌疾病进展有关，提供了肿瘤逃脱NK细胞调节肿瘤免疫的一个新的机制。那么，作为HIV感染过程中最先参与抗病毒反应的NK细胞，是否NK细胞功能的紊乱与四个亚群的改变有关？以及亚群的变化与HIV疾病进展是否有关？相关机制如何？国内外未报道，值得我们去深入研究和探索。本研究为了探究在HIV感染过程中NK细胞的功能紊乱是否与CD27与CD11b定义的亚群改变有关，以及各亚群的变化与HIV疾病进展的关系和发生的机制。为更好的防治HIV病毒感染以及研究HIV发生发展机制奠定重要基础，同时为HIV病毒逃脱NK细胞调节的抗病毒免疫提供一个新的机制。 方法：选取中国医科大学附属第一医院红丝带门诊的HIV感染者，包括新发感染者、慢性感染者、HARRT治疗者，以及正常对照者。实验方法包括：CD4+T细胞绝对值检测将CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP试剂加入绝对计数管中，逆向加样法加入抗凝全血，加入1×免洗溶血素，应用FACS Calibur流式细胞仪进行检测，MultiSET软件分析结果；HIV病毒载量测定取EDTA抗凝血浆，采用Roche公司COBAS(@) AmpliPrep(@)/COBAS(@)TaqMan(@) System自动载量仪上以实时荧光定量PCR方法测定病毒载量；NK细胞、CD4+T细胞表面受配体的检测采用全血染色，加入相应的荧光抗体及同型对照等进行避光染色。加入溶血素，1％多聚甲醛FACS LSRⅡ流式细胞仪上机检测；CD27与CD11b定义的NK细胞亚群分泌IFN-γ的情况提取HIV感染者PBMC，于96孔板中加入刺激物，在收细胞前6h加入Golgistop，培养箱中培养48h。收细胞，加入荧光抗体表面染色，离心洗涤后破膜胞内IFN-γ遮光染色，1％多聚甲醛上机检测；血清中可溶性ICAM-1的检测采用ELISA方法检测正常人和HIV感染者血清中可溶性ICAM-1，按照说明书操作步骤进行操作；TGF-β对CD11b与CD27定义的NK细胞亚群表达量的影响提取正常人PBMC，与TGF-β共培养。加入荧光抗体，1％多聚甲醛固定上机检测；含高浓度可溶性ICAM-1的HIV感染者血浆对CD27与CD11b定义的NK细胞亚群的影响提取正常人PBMC，加入含有高浓度可溶性ICAM-1的HIV感染者血清，培养48h。荧光单克隆抗体染色，离心洗涤，加入1％多聚甲醛上机检测；统计学分析应用SPSS19.0软件包进行统计分析，比较组间差异采用参数检验或者非参数检验。相关性分析采用Spearman秩相关检验，P＜0.05为有统计学意义。 结果：⑴HIV感染者CD11b与CD27定义的NK细胞亚群发生明显的变化且与疾病进展有关。HIV慢性感染者表达的CD11b显著降低，经治疗后有所恢复但仍低于正常人(P＜0.001)。HIV感染者NK细胞未成熟DN亚群在慢性感染者中明显增多，经HARRT治疗后，虽有所恢复但仍显著高于正常入水平(P＜0.001)。杀伤功能亚群CD11b+SP在慢性感染者显著降低，经治疗后有所恢复但仍低于正常人水平(P＜0.001)。HIV感染者中未成熟DN亚群与CD4+T细胞绝对数成负相关(r=-0.320，P=0.012)，杀伤功能亚群CD11b+SP与CD4+T细胞绝对数成正相关(r=0.375，P=0.003)。HIV慢性感染者CD27+SP亚群与病毒载量成显著的正相关(r=0.548，P=0.015)。CD27+SP亚群和DN亚群在HIV感染者中不论疾病进展好还是不好均高于正常人，但疾病进展不好的人群表达的较疾病进展好的人群高。CD11b+SP正常人显著高于HIV感染者，但疾病进展好的HIV感染者高于疾病进展不好的人群。⑵HIV感染者CD11b与CD27定义的NK细胞亚群功能研究。CD27+SP、DP、CD11b+SP亚群分泌IFN-γ的功能明显高于DN亚群。⑶传统NK细胞亚群与CD11b和CD27定义NK细胞亚群的区别与联系。与CD27和CD11b定义的NK细胞亚群相比，传统的NK细胞亚群与HIV疾病进展关系并不显著。在CD56bright亚群中主要表达DP和CD11b+SP亚群，在CD56dim亚群中主要表达CD11b+SP亚群。DN亚群与CD56bright亚群呈负相关，CD27+SP亚群和DP亚群与CD56dim呈显著负相关，CD11b+SP与CD56dim呈显著正相关。⑷HIV感染者CD11b与CD27定义的NK细胞亚群变化的相关机制研究。将TGF-β与PBMC共培养，实验结果显示，TGF-β能明显促进未成熟DN亚群增多，且具有统计学意义(P=0.045)。HIV感染者CD4+T细胞上膜性ICAM-1与正常人相比无明显的变化，而HIV感染者血清中sICAM-1表达水平增高(P＜0.001)，HARRT治疗后虽然有所降低但仍高于正常入水平(P=0.004)。将含有高浓度sICAM-1的HIV感染者血清与正常人PBMC共培养，结果显示，加入含有高浓度sICAM-1的HIV感染者血清的实验组较对照组未成熟DN亚群明显增高而杀伤功能亚群CD11b+SP明显降低。 结论：①与正常入相比，CD11b与CD27定义的NK细胞亚群在HIV感染者中发生明显的变化，DN亚群明显增多，CD11b+SP亚群明显减少。②增多的DN亚群与HIV感染者疾病的恶化有关。③与传统亚群相比，CD11b与CD27定义的NK细胞亚群与HIV疾病进展关系更为显著。④HIV感染者增多的DN亚群可能与HIV感染者血浆中增高的TGF-β、sICAM-1有关。