弯曲菌(Campylobacter)是一种细长呈弯曲螺旋状的革兰阴性微需氧菌,一般具有极端鞭毛,是家禽和多种哺乳动物的肠道共生菌。弯曲菌中能引起人类感染的主要是空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni,简称 C.jejuni)和结肠弯曲菌(Campylobacter coli,简称 C.coli)。人感染弯曲菌后主要症状为腹泻、腹痛、发热和呕吐等,严重的可引起反应性关节炎和格林巴利综合症等后遗症,甚至在一些情况下可导致死亡。近年来世界范围内弯曲菌病病例发生率的指数增长趋势引起世界卫生组织(WHO)和各国政府的高度关注。家禽是弯曲菌的天然宿主,被感染鸡肠道内弯曲菌定殖量可达106～109cfu/g,并且持续到屠宰前,造成屠宰过程中胴体及零售环节禽肉产品的交叉污染,给食品安全和公共卫生带来严重隐患。研究表明消费、处理污染的禽肉或直接接触弯曲菌感染的家禽是人类弯曲菌病的最主要来源。控制或减少家禽弯曲菌感染是预防和控制人弯曲菌病的重要前提。尽管研究者们已作出了很多努力,但到目前为止世界范围内仍没有一个切实有效的方法来防控鸡群中弯曲菌的感染。因此继续了解家禽养殖过程中弯曲菌的流行传播特点,分析鸡群中弯曲菌的可能来源并有针对性地制定有效的防控措施显得尤为重要。本研究选择规模化鸡场的部分鸡群,从种蛋孵化到饲养一定阶段内对鸡群及周围环境中弯曲菌的定性定量流行特点进行研究,应用建模软件对部分鸡群养殖过程中不同时间点弯曲菌实际带菌量进行拟合,获得弯曲菌生长动力学方程;对不同来源及不同饲养时间点的分离菌株进行分子亚分型分析,以了解其在家禽养殖环节的传播规律,探究鸡群中弯曲菌的可能来源;制备空肠弯曲菌亚单位候选疫苗并对其免疫效果进行评价,为鸡养殖过程中弯曲菌的防控提供研究基础。1鸡养殖过程弯曲菌流行特点分析2013年5月至2014年6月先后选择饲养管理模式不同的A、B、C 3个规模化鸡场。鸡场A为笼养模式,每间鸡舍无固定饲养员,饲养场区无严格的生物安全消毒措施;鸡场B和C为平养模式,每间鸡舍均为固定饲养员,具有良好的生物安全消毒措施。对选自3个鸡场的17个鸡群分别采集孵化阶段的种蛋表面擦拭样品、饲养阶段每周的泄殖腔棉拭样品以及部分同步采集的鸡舍内外环境样品(槽内饲料、饮用水、垫料、地面擦拭样品、饲养员鞋底擦拭样品、周围污水、土壤、空气和苍蝇等),用CCDA平板分离法对所有样品进行弯曲菌的分离培养,多重PCR方法鉴定其种属,同时用荧光定量PCR方法对泄殖腔棉拭子样品进行弯曲菌定量检测,以了解不同鸡群养殖过程中弯曲菌的流行特点。结果显示所有鸡群均在2周龄后出现弯曲菌感染,鸡群中一旦出现弯曲菌感染便会迅速传播,最高感染率可达100%,最高带菌量可达6.28 log cfu/g粪便;相同饲养模式下鸡场B弯曲菌出现时间较鸡场C滞后1～2周,鸡群的初始带菌量显著低于鸡场C(P<0.05);笼养模式的鸡场A其最高感染率低于平养模式的鸡场B和C,其中A、B差异显著(P<0.01);同一鸡场不同品种鸡比较结果显示MQ、W鸡群3周龄时感染率显著高于其相同鸡场的其它鸡群,高产黄肉种鸡最高带菌量显著高于如皋草鸡和MQ鸡群(P<0.05);鸡群中空肠弯曲菌分离率高于结肠弯曲菌,且存在同一只鸡混合感染空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的现象,最高混合感染率可达33%;环境样品分离结果显示,鸡场A周围污水和鸡场C饲养员鞋底擦拭样品分离率较高(21.5%、29.4%),其他样品弯曲菌分离率较低(1.0%～8.3%);鸡场A的空气样品、饲料样品、饮水、风扇擦拭及地面擦拭样品、鸡场C的污水均未分离到弯曲菌;结肠弯曲菌占据环境样品分离株的91.5%(43/47)。自然感染鸡血清弯曲菌抗体监测结果显示1日龄雏鸡血清中含有一定的母源抗体,随后抗体水平逐渐降低,2～3周龄达最低后又逐渐上升。以上研究为进一步了解家禽养殖环节弯曲菌的流行传播特点,探索鸡群中弯曲菌的可能来源提供了基础数据。2鸡养殖过程弯曲菌生长预测模型的建立为了解弯曲菌在鸡养殖过程中的生长动力学特征,预测各鸡群不同饲养阶段弯曲菌的带菌量,本研究在获得部分鸡群弯曲菌定量数据的基础上,对养殖过程中鸡体内弯曲菌的生长动力学特征进行研究,建立了 3个不同鸡场6个鸡群养殖过程中弯曲菌带菌量与时间的关系曲线,结果显示同一鸡场的鸡群具有相似的曲线特征,所有鸡群在弯曲菌出现后1～2周其带菌量达到峰值,随后有下降的趋势并有所波动。如皋草鸡鸡群、麻鸡、油鸡鸡群弯曲菌初始带菌量在2.5 log cfu/g左右,而J+、J-、W鸡群弯曲菌初始带菌量为3～4 log cfU/g;如皋草鸡鸡群弯曲菌最高带菌量小于4 log cfU/g,而其它鸡群弯曲菌最高带菌量均在5.5～61ogcfu/g。应用MATLAB(R2015b)软件对各鸡群养殖过程中不同时间点弯曲菌实际带菌量进行拟合,获得弯曲菌生长动力学方程为fx= b1+b2x2+b3√e xp(b4x2+b5xb6>,该方程中fx为鸡体内弯曲菌带菌量的对数值,x表示时间。b1、b1、b3、b4、b5、b6为方程的6个参数,针对不同的鸡群此方程中参数的取值不同。拟合结果显示拟合到方程的曲线与鸡群弯曲菌带菌量的实测值较为吻合,可较好地描述鸡群不同时间点弯曲菌带菌量的变化趋势,应用该方程可较准确地预测进入屠宰环节时鸡群弯曲菌带菌量。把握养殖过程中弯曲菌生长动力学特征可为农场弯曲菌防控措施的制定提供参考,为鸡养殖过程中弯曲菌定量风险评估提供基础,同时可较方便地预测鸡群进入屠宰环节时的带菌量,为屠宰前的分级处理提供便利。3基于MLST的鸡养殖过程中弯曲菌传播规律的分子流行病学研究为进一步明确不同饲养阶段鸡群弯曲菌分离株的遗传特性及不同来源分离株的遗传相关性,了解弯曲菌在鸡群中的传播规律,本研究选取弯曲菌7个管家基因aspA、glnA、gltA、glyA、pgm、tkt、uncA,选择鸡养殖环节不同时间点和不同来源的代表性弯曲菌分离株220株(空肠弯曲菌76株,结肠弯曲菌144株)进行MLST分型研究,结果显示,220株分离株共分成23种不同的序列型,分属7种同源复合体和独特型;6种ST型(空肠弯曲菌5种,结肠弯曲菌1种)数据库中未定义,属于新序列型;各管家基因等位基因值的数量分析表明结肠弯曲菌中的gltA、aspA和uncA三个基因较为稳定;空肠弯曲菌的优势序列型是ST-2140,优势克隆复合体是ST-574,结肠弯曲菌的优势序列型是ST-5506,优势克隆复合体是ST-828;—定饲养阶段内同一鸡群不同时间点弯曲菌分离株ST型较一致,总体表现出较高的遗传稳定性,但同时也表现出遗传多样性;不同鸡场弯曲菌分离株ST型分析表明以平养方式饲养的鸡场B、C比以笼养方式饲养的鸡场A的分离菌株其ST型表现出更高的一致性;鸡场不同来源弯曲菌ST型分析表明,环境样品分离株的ST型与鸡群泄殖腔棉拭子分离株的ST型一致,推测鸡场A周围污水是弯曲菌的重要储库,并有通过苍蝇传播的可能,鸡场C弯曲菌有可能通过人员鞋底、饲料、饮水等进行传播,环境因素是鸡群中弯曲菌的主要来源。以上研究为制定针对各鸡场的弯曲菌防控措施提供了科学依据。4空肠弯曲菌亚单位候选疫苗的制备及其初步免疫评价为探索研制有效诱发鸡体产生弯曲菌中和抗体并减少肠道内弯曲菌定殖量的亚单位疫苗,本研究扩增空肠弯曲标准菌株NCTC11168 fliD基因并构建原核表达质粒pColdⅠ-fliD和pGEX-6p-1-fliD,利用大肠杆菌表达系统表达FLiD重组蛋白并进行纯化;Western-blot方法验证重组蛋白rHis-FLiD与His单抗的免疫反应性。重组蛋白与法国Seppic公司生产的禽用矿物油佐剂Montanide乳化后肌肉注射7日龄、17日龄肉鸡,经两次免疫后1周进行109cfU/只鸡空肠弯曲菌攻毒,于攻毒后3、7、11日龄分别宰杀部分鸡只,采集盲肠组织及盲肠内容物定量检测其弯曲菌含量。采集1、17、24、27、31、35日龄各组鸡血清,ELISA检测血清中抗弯曲菌抗体含量。研究结果表明成功表达并纯化rHis-FLiD重组蛋白,蛋白与His单抗具有较好的免疫反应性。动物实验结果显示二免后1周即24日龄时FLiD蛋白加佐剂免疫组血清抗体显著高于对照组(P<0.01),而空载体免疫组血清抗体与对照组相比无显著差异;口服攻毒试验结果显示,攻毒后11 d,FLiD蛋白加佐剂免疫组鸡盲肠组织及盲肠内容物弯曲菌含量显著低于对照组(P<0.01),与对照组相比均降低约4 log值,空载体免疫组与对照组相比无显著差异。以上研究结果表明,FLiD蛋白与佐剂乳化后免疫鸡可有效产生弯曲菌特异性血清抗体IgG,显著降低口服攻毒鸡盲肠内容物及盲肠组织弯曲菌含量,具有一定的开发亚单位疫苗的前景。