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目的:
观察积雪草酸(asiaticacid,AA)对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞氧化应激及细胞外基质分泌的影响,探讨其对糖尿病肾病的保护作用。
方法:
体外培养大鼠肾小球系膜细胞,分为正常对照组(NG组,葡萄糖浓度5.5mmol/L)、高糖损伤组(HG组,葡萄糖浓度30mmol/L)、不同浓度AA干预组(HG+1nmol/LAA组、HG+10nmol/LAA组、HG+100nmol/LAA组)。分别培养1周、2周、3周后,采用荧光探针DCFH-DA进行活性氧(ROS)的检测,荧光显微镜下直接观察细胞内活性氧的水平,荧光酶标仪检测细胞荧光强度;分光光度计法检测细胞上清液中脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量的变化;分光光度计法检测细胞上清液中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)活力的变化;Westernblotting法检测细胞血红素氧合酶-1(HO-1)蛋白的表达;RT-PCR检测细胞转化生长因子β1(TGF-β1)mRNA的水平;ELISA法检测细胞上清液TGF-β1以及细胞外基质成分纤连蛋白(FN)、Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)水平的变化。
结果:
1.荧光显微镜直接观察细胞内ROS水平:用DCFH-DA标记细胞在镜下呈绿色荧光,NG组荧光很弱,HG组荧光最强,不同浓度AA干预组较HG组荧光均减弱,且随AA浓度增加,荧光减弱越明显。荧光酶标仪检测细胞ROS水平:HG组较同一时间NG组明显增加(P＜0.05),且随时间延长而增加(P＜0.05);不同浓度AA干预组均较同一时间HG组有明显下降(P＜0.05),且里剂量依赖性(P＜0.05),10nmol/L、100nmol/LAA干预组可恢复到正常水平。
2.细胞上清液中MDA水平的变化:HG组较同一时间NG组有明显增加(P＜0.05),且随时间延长而增加(P＜0.05);HG+1nmol/LAA组较同一时间HG组有下降趋势,但无统计学意义;HG+10nmol/LAA组和HG+100nmol/LAA组均较同一时间HG组有明显下降(P＜0.05),且呈剂量依赖性(P＜0.05);HG+100nmol/LAA组可恢复到正常水平。
3.细胞培养液上清中SOD、GSH-PX活力的变化:HG组较同一时间NG组有明显降低(P＜0.05),并且第3周较第1、2周又有明显的降低(P＜0.05);HG+1nmol/LAA组较同一时间HG组有上升趋势,但无统计学意义;HG+10nmol/LAA组和HG+100nmol/LAA组较同一时间HG组有明显增加(P＜0.05),并且100nmol/LAA可以使两者的活性恢复到正常水平。
4.细胞培养液上清中CAT活力的变化:HG组较同一时间NG组有明显降低(P＜0.05);HG+10nmol/LAA组和HG+100nmol/LAA组均较同一时间HG组有明显增加(P＜0.05),且呈时间和剂量依赖性(P＜0.05),到第3周时HG+100nmol/L从组可恢复到正常水平。
5.细胞HO-1蛋白表达水平的变化:HG组较同一时间NG组有明显增加(P＜0.05),而随时间延长无明显变化;不同浓度从干预组均较同一时间HG组有明显增加(P＜0.05),但随从浓度的增加及干预时间的延长无明显变化。
6.细胞TGF-β1mRNA水平的变化:HG组较同一时间NG组有明显增加(P＜0.05),而随时间延长无明显变化:HG+1nmol/L从和HG+10nmol/L从组较同一时间HG组已有下降趋势,但无统计学意义;HG+100nmol/L从组较同一时间HG组有明显下降(P＜0.05),并能恢复到正常水平。
7.细胞上清中TGF-β1水平的变化:HG组较同一时间NG组有明显增加(P＜0.05),而随时间延长无明显变化;HG+1nmol/LAA组和HG+10nmol/LAA组较同一时间HG组有下降趋势,但无统计学意义;HG+100nmol/LAA组较同一时间HG组有明显降低(P＜0.05),并能恢复到正常水平。
8.细胞上清中FN分泌量的变化:HG组较同一时间NG组有显著增加,且随时间延长而增加(P＜0.05);HG+1nmol/LAA组较HG组有下降趋势,但无统计学意义;HG+10nmol/L从组和HG+100nmol/L从组均较HG组有明显下降(P＜0.05),并可恢复到正常水平。
9.细胞上清中Col-Ⅳ分泌量的变化:HG组较同一时间NG组有明显增加(P＜0.05),而随时间延长无明显变化;HG+10nmol/LAA组和HG+100nmol/LAA组均较同一时间HG组有明显下降(P＜0.05),且呈剂量依赖性(P＜0.05);HG+100nmol/LAA组可恢复到正常水平。
结论:
高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞内ROS水平增加,抗氧化酶SOD、GSH-PX、CAT活力下降,HO-1蛋白表达水平增加:TGF-β1mRNA和蛋白水平表达增加,细胞外基质成分FN、Col-Ⅳ的分泌量增加。从可通过清除高糖环境下产生过多的ROS,增加抗氧化能力,降低TGF-β1水平,减少细胞外基质成分的分泌量,发挥对糖尿病肾病的保护作用。