一、基于微载体和纤维蛋白基质的体外血管新生三维模型构建 目的：建立人微血管内皮细胞的分离，纯化，培养技术，并用纯化的内皮细胞构建血管新生三维模型，为后面的腺病毒干预的三维模型的建立奠定基础。 方法：1．取人包皮，Dispase消化，EGM培养，CD31免疫磁珠纯化两次后，用VⅧ因子相关抗原做免疫组化，鉴定所得内皮细胞的纯度。2．将内皮细胞包被在微载体上，将包被有内皮细胞的微载体包埋在由EGM配制的三维纤维蛋白凝胶中培养，于不同的时间点拍照观察。结果：1．纯化后的内皮细胞经过免疫组化鉴定，纯度达到95％以上。2．在bFGF的诱导下，包被在微载体上的内皮细胞形成出芽（sprouts）状结构，出芽不断延长，形成具有的内腔的毛细管样结构（CLScapillary like structure），最后汇合形成血管网。 结论：成功分离纯化了人微血管内皮细胞，并且其纯度达到95％，可以用于进一步实验；成功地用纯化的内皮细胞构建了三维血管新生模型，该模型能很好地反映出体内血管新生地一系列步骤，可以定量，在血管新生的相关研究领域有着广泛的用途。 二、腺病毒感染的体外三维血管新生模型构建 （一）cdc42基因腺病毒表达载体的制备 目的：制备空载腺病毒和cdc42高表达腺病毒，为三维模型的腺病毒干预准备载体。方法：1．从肝癌标本的ttRNA的反转录产物中克隆cdc42，测序鉴定后接入pATC。2．将其与腺病毒骨架质粒重组。3．筛选重组质粒。4．大量制备阳性重组质粒，转染293A细胞。5．用从293A细胞中收获的第一代病毒感染293A细胞，扩增出第二代病毒，用于实验。结果：cdc42测序证明序列完全正确；重组质粒中PCR证明cdc42存在于重组成功的质粒中；第一代腺病毒的滴度达到1×10<’7>，扩增后第二代病毒滴度达到6×10<’8>，可以用于细胞生物学实验。结论：成功制备了用于构建腺病毒感染的三维模型的空载腺病毒和cdc42高表达的腺病毒，并且滴度符合要求。 （二）空载腺病毒感染的体外三维血管新生模型。 目的：通过形态发生和定量，比较空载腺病毒感染的血管新生三维模型和非感染的对照模型的差别，探讨感染对于三维模型中血管新生的影响及用腺病毒作为干预手段的可行性。方法：1．确定感染复数。2．代数在第五代到第七代的内皮细胞 生长汇合后，感染，包被微载体。3．将包被有内皮细胞的微载体包埋在由EGM配制的三维纤维蛋白凝胶中培养，于不同的时间点拍照观察。结果：两种模型的血管生成步骤和形态几乎没有差别。对照模型从第一天到第五天的平均出芽长度（average lengths of sprouts, ALS）分别为：22.26±16.10pm，98.22±50.45μm，157.37±75.69μm，183.21±74.16μm，222.93±160.54μm；腺病毒感染的模型从第一天到第五天的ALS分别为：14.26±10.23μm，75.76±36.74μm，138.66±77.18μm，187.72±97.31μm，208.88±81.92μm。在最初的两天内，两种模型的ALS有显著差异（P<0.01.），随着时间推移，从第三天到第五天ALS的差异越来越不显著（p>0.01）。结论：我们成功构建了一种腺病毒感染的体外三维血管新生模型，而且腺病毒感染对血管生成的形态和数量没有明显的影响，为进一步对血管生成过程中相关目的基因的功能研究建立了技术平台。 （三）腺病毒载体介导的cdc42高表达对血管新生模型的影响 目的：通过形态发生和定量，比较cdc42高表达腺病毒感染的血管新生三维模型和空载腺病毒感染的对照模型的差别，考察模型中cdc42高表达的维持情况，以及这种高表达对于三维血管新生的影响。方法：1．确定感染复数。2．代数在第五代到第七代的内皮细胞生长汇合后，感染，包被微载体。3．将包被有内皮细胞的微载体包埋在由EGM配制的三维纤维蛋白凝胶中培养，于不同的时间点拍照观察。4．在选定的时间点抽提模型ttRNA，验证高表达情况。 结果：两种模型的血管生成步骤和形态有显著差别。对照模型从第一天到第五天的平均出芽长度分别 为 ：74.32±21.00μm，294.86±47.19μm，526.69±107.65μm，754.75±74.16μm，950.35±225.01μm；Cdc42高表达腺病毒感染的模型从第一天到第五天的ALS分别为： 98.71±30.67μm，472.33±92.67μm，920.29±143.72μm，1190.75±212.28μm，1418.52±211.29μm。通过SPSS的Independent-samples ttest比较，从第一天到第五天，两种模型的ALS有显著差异（p<0.01）。cdc42的高表达在模型中可以维持一周。 结论：以腺病毒为载体介导的cdc42高表达在血管新生模型发展的整个过程被有效地维持；cdc42高表达对于血管新生有明显的促进作用。