【摘 要】
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为高效制备奶牛胎盘还原性多肽并探究其组成成分,本研究使用超声破碎法、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解法制备奶牛胎盘多肽冻干粉,计算提取率后,通过普鲁士蓝法测定其还原力。使用正交试验法和响应面法,建立其具有最高还原力和提取率的制备条件,以上述指标建立综合提取率作为奶牛胎盘多肽提取条件,利用响应面法进一步优化提取条件。并基于Label-Free技术鉴析奶牛胎盘还原性多肽组成成分,利用BIOPEP活性
【基金项目】
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四川省科技厅科技计划项目（2019YJ0650）； 国家重点研发计划项目（2018YFD0500900）； 四川农业大学学科建设双支计划（03571303）；
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为高效制备奶牛胎盘还原性多肽并探究其组成成分,本研究使用超声破碎法、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解法制备奶牛胎盘多肽冻干粉,计算提取率后,通过普鲁士蓝法测定其还原力。使用正交试验法和响应面法,建立其具有最高还原力和提取率的制备条件,以上述指标建立综合提取率作为奶牛胎盘多肽提取条件,利用响应面法进一步优化提取条件。并基于Label-Free技术鉴析奶牛胎盘还原性多肽组成成分,利用BIOPEP活性多肽数据库筛选具有潜在还原性的多肽,分析还原性多肽活性残基,为奶牛胎盘的利用和进一步研究提供理论基础。试验一奶牛胎盘还原性多肽高效提取方法的建立和优化结果显示:（1）奶牛胎盘含有天然还原性多肽,超声破碎法提取最佳条件为50%浓度、1800w功率破碎7.5min,提取率为0.95%,Vit C当量为2.80μg/mg。胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶分别在反应时间5.78h、6.18h、6.22h,底物浓度30.21%、34.78%、30.71%和酶底比3.24%、5.00%、3.18%时取得最高提取率,分别为5.55%、6.97%和6.14%;分别在反应时间5.13h、3.95h、4.83h,底物浓度35.59%、34.78%、35.82%和酶底比4.19%、3.64%、3.57%时取得最高Vit C当量,分别为39.32μg/mg、70.54μg/mg和58.59μg/mg。（2）非还原性蛋白可被胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解为具有还原力的多肽,以木瓜蛋白酶酶解效果最佳。除胰蛋白酶外,木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解奶牛胎盘所制备多肽的提取率与还原力相关性不显著,且胎盘多肽提取率随各因素水平升高呈上升趋势,而还原力则先上升后下降。（3）经综合提取率优化,胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶分别在反应时间为5.80h、4.70h、5.49h,底物浓度为34.96%、34.03%、35.74%和酶底比为3.33%、3.66%、3.92%时取得最佳提取效果,其综合提取率分别为2037.92μg/g、4414.09μg/g和3490.41μg/g。试验二基于Label-Free技术鉴析奶牛胎盘还原性多肽成分结果显示:（1）胰蛋白酶组、木瓜蛋白酶组和胃蛋白酶组分别鉴定出541种、86种和137种蛋白,除去各组重复蛋白,分别占所鉴定蛋白总数74.40%,11.80%和18.80%,共727种蛋白;胰蛋白酶组、木瓜蛋白酶组和胃蛋白酶组分别鉴定出2766种、129种和1171种多肽,除去各组重复多肽,分别占所鉴定多肽总数64.00%,2.90%和27.10%,共4321种多肽;表明木瓜蛋白酶对奶牛胎盘蛋白酶解最为彻底,胃蛋白酶次之,胰蛋白酶最低。（2）奶牛胎盘多肽还原性能力多由异亮氨酸-精氨酸、谷氨酸-亮氨酸和亮氨酸-赖氨酸等残基提供。结论:（1）奶牛胎盘含有天然还原性多肽,胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶分别在反应时间5.8h、4.7h、5.49h,底物浓度34.96%、34.03%、35.74%和酶底比3.33%、3.66%、3.92%时取得最佳提取效果,其综合提取率分别为2037.92μg/g、4414.09μg/g和3490.41μg/g。其中,木瓜蛋白酶酶解奶牛胎盘多肽最为彻底,效果最佳;（2）奶牛胎盘多肽的还原能力多由异亮氨酸-精氨酸、谷氨酸-亮氨酸和亮氨酸-赖氨酸等残基提供。
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