论文部分内容阅读
背景和目的肝脏纤维化是慢性肝脏损伤最重要的表现之一,目前发生机制尚未阐明,缺乏有效治疗药物。奥贝胆酸（obeticholic acid,OCA）是法尼酯受体X（farnesoid-X receptor,FXR）激动剂,研究表明OCA可通过抑制炎症和肝细胞凋亡减轻D-氨基半乳糖/脂多糖所致的急性肝损伤,同时OCA可减轻博来霉素引起的大鼠肺纤维化,但作用机制不明。本研究拟在建立四氯化碳（carbon tetrachloride,CCl4）诱导小鼠肝脏纤维化模型基础上,观察OCA对肝脏纤维化的作用并进一步探讨其可能机制。方法将96只8周雄性CD-1小鼠分为四组:对照组、单纯OCA组、单纯CCl4组、CCl4+OCA组,每组24只。对照组,给予小鼠空白OCA溶剂灌胃（每天一次）及玉米油腹腔注射处理（每周两次）;单纯OCA组,给予小鼠OCA灌胃处理（OCA 5mg/kg,每天一次）;单纯CCl4组,给予小鼠CCl4腹腔注射处理（CCl40.15ml/kg,每周两次）;CCl4+OCA组,给予小鼠OCA灌胃处理（OCA 5mg/kg,每天一次）和CCl4腹腔注射处理（CCl40.15ml/kg,每周两次）。自首次CCl4处理后3周和6周,每组分别剖杀12只小鼠,剖杀前禁食12小时。称取小鼠体重和肝脏重量,计算肝重-体重系数;留取血清样本检测肝脏生化指标谷丙转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）和总胆汁酸（total bile acid,TBA）;留取肝脏组织,一部分于4%多聚甲醛中固定后石蜡包埋切片,肝脏病理组织进行苏木素伊红（hematoxylin and eosin,H&E）染色、天狼星红染色、α-SMA免疫组化染色;另一部分肝脏立即冷冻于液氮中并转移至-80℃冰箱保存,以进行timp-1、mmp-2、mmp-9等指标的实时定量PCR（real time PCR,RT-PCR）检测和FXR、TIMP-1、MMP-9、α-SMA、psmad3等指标的蛋白质免疫印迹（Western blot,WB）检测;肝脏组织同时进行了组织羟脯氨酸（hydroxyproline,Hyp）的含量检测。结果与对照相比,CCl4处理在3周和6周均升高了小鼠肝脏绝对重量和肝脏-体重系数,而OCA处理在两个时间点均明显缓解了肝脏肿大。同时,与对照相比,CCl4处理在3周和6周均明显升高小鼠肝脏生化指标AST、ALT、TBA,而OCA处理明显降低6周组ALT、AST、TBA,而对3周组ALT、AST、TBA无显著影响。肝脏H&E染色病理图片显示,相比对照组,CCl4处理在3周和6周造成肝脏组织炎性细胞积聚、纤维沉积、组织结构破坏、假小叶形成,OCA处理在3周和6周组均减轻了肝脏损害与肝脏纤维化改变。肝脏组织天狼星红染色与Hyp含量检测显示CCl4处理明显诱导纤维蛋白在肝组织内沉积,而OCA处理明显降低肝脏纤维蛋白含量。相比于对照,CCl4处理明显升高金属蛋白酶timp-1、mmp-2、mmp-9 m RNA表达,OCA处理6周明显抑制timp-1、mmp-2、mmp-9 m RNA升高;同时CCl4处理明显升高TIMP-1与MMP-9蛋白表达,OCA处理6周抑制TIMP-1与MMP-9蛋白表达。CCl4处理增加肝脏α-SMA和p Smad3蛋白表达,OCA处理减轻CCl4诱导的α-SMA和p Smad3蛋白表达。进一步研究表明,OCA增加肝细胞核内FXR蛋白表达;免疫共沉淀实验发现OCA增加FXR与Smad3的相互作用。结论在本实验的条件下,FXR激动剂OCA增加FXR与Smad3的相互作用,减轻CCl4诱导的肝脏损伤与肝纤维化。