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植物激素脱落酸(abscisic acid,ABA)可以参与调节植物抗逆境(包括干旱、冷害、盐害等)的多种生理反应。近年来,植物激素ABA作为重要信号分子的研究越来越深入广泛.已有研究表明ABA的作用模式与植物细胞中氧化胁迫有关,ABA能够诱导NADPH氧化酶引起活性氧产生及抗氧化基因的表达,从而提高植物抗氧化防护能力。植物热激转录因子(heat shock transcription factors,Hsfs)作为植物热激反应时的主要调控因子,在植物热激胁迫下的研究已经非常丰富深入.除了热激反应外,热激转录因子还参与了植物其他非生物胁迫如干旱和氧化等胁迫的反应过程,并通过调节胁迫基因的表达而提高植物氧化胁迫耐性.但是关于ABA诱导的氧化胁迫信号途径与植物热激转录因子Hsfs基因关系方面的研究尚未见报道.为此,本实验以水稻为研究对象,利用生物信息学和分子生物学相结合的方法,以半定量RT-PCR为主要研究手段对水稻中两条OsHsfs基因OsHsfA4a和OsHsfA2与ABA和H2O2的关系进行了研究.主要结果如下:
采用半定量RT-PCR方法,100μmol·L-1 ABA处理后,水稻OsHsfA4a和OsHsfA2基因的转录水平和对照相比,分别在4h处理时间内的30min和180min产生两个上调表达高峰;10 m mol·L-1 H2O2处理后,水稻OsHsfA4a和OsHsfA2基因的转录水平和对照相比,分别在4 h处理时间内的15 min和120 rain产生两个上调表达高峰;H2O2清除剂DMTU、CAT和抑制剂DPI预处理后的样品较对照样品,所有时间点OsHsfs基因表达情况和对照近乎相同,说明预处理后的ABA处理没有诱导水稻OsHsfs基因表达增强。H2O2清除剂预处理后ABA诱导产生的H2O2被有效清除了,ABA不能诱导水稻OsHsfs基因表达增强.证明了ABA诱导水稻OsHsfs基因表达增强是通过ABA诱导产生的内源H2O2来起作用的.这些结果初步阐明了在ABA信号途径中ABA、H2O2与植物热激转录因子三者之间的关系,从而为ABA诱导植物细胞抗氧化防护系统的信号转导途径提供了新的证据.
原生质体瞬间表达系统以游离分散的植物细胞和原生质体为研究对象,借助物理或化学方法将外源DNA直接导入植物细胞,使DNA进入植物细胞核,并在短期内能够检测到基因表达产物-新蛋白质的合成和酶的活性.至今原生质体瞬间表达系统已经广泛应用于诸如不同的调控顺序和基因功能,植物激素、紫外光、热激、厌氧条件、代谢产物等各种内外因素对基因表达影响的研究。本实验通过分子生物学方法克隆了两条受ABA诱导的OsHsfA4a基因OsHsfA4a和OsHsfA2的全长ORF序列,进一步成功构建了含有目的基因和以黄色荧光蛋白(yellow fluorescent proteins,YFP)为报告基因的重组原生质体瞬间表达载体,为以后水稻原生质体瞬间表达体系转化等工作做准备,为进一步研究ABA诱导的OsHsfs在水稻原生质体瞬间表达体系中的亚细胞定位以及ABA诱导的OsHsfs基因表达与ABA诱导的抗氧化防护基因如:Sod4,Cat1及Apx1等表达的关系做准备,为深入了解和丰富ABA信号转导途径网络关系图奠定基础