小麦是重要的粮食作物之一，小麦的生产及小麦的产量和品质关系到世界粮食安全问题。小麦种子的形成和发育直接影响着小麦产量和品质。microRNA（miRNA）是近年来发现的真核生物体内普遍存在的一类具有重要调控功能的非编码小分子RNA（sRNA），其大小在20-25nt之间。大量研究发现miRNA参与基因转录后调控；在植物的生长、发育和逆境胁迫应答等各种生物学过程中发挥重要的调节作用。迄今，植物miRNA的研究已经取得了很大进展； miRBase数据库（Release21, June2014;http://www.mirbase.org）中登录注册的植物成熟miRNA已有10892条；其中的绝大多数miRNA都是来自于全基因组序列已知的水稻（713条）、杨树（401条）、拟南芥（427条）、二穗短柄草（525条）、玉米（321条）等物种。关于miRNA在植物种子发育中的调控作用已在水稻、拟南芥、玉米、大麦等物种展开研究。相比之下，小麦染色体组复杂，基因组庞大，全基因组序列组装尚待完成；小麦中鉴定出的miRNA数量非常有限，在miRBase中登录注册的小麦miRNA仅有119条。因此，小麦miRNA的鉴定及其功能研究亟待加强。本研究以我国优异小麦品种小偃6号作为实验材料，构建了幼苗、旗叶和花后5天、10天及20天籽粒的5个样品的sRNA库，并对其进行深度测序及生物信息学分析；从5个sRNA库中识别鉴定miRNAs和trans-acting siRNA（tasiRNAs）；对鉴定出的miRNAs在不同器官和不同发育时期的时空表达模式进行分析；并对鉴定出的miRNAs进行靶基因预测，以便初步了解这些miRNAs的功能。此外，本研究还探索了在小麦中利用大麦条斑花叶病毒（Barley Stripe Mosaic Virus，BSMV）载体介导人工miRNA或miRNA过表达的可能性。本研究的主要目的在于鉴定小麦旗叶和不同发育时期籽粒中特异表达的miRNAs，丰富miRBase中小麦miRNA的信息；为进一步研究miRNA在小麦生长、发育，尤其是在旗叶和籽粒生长发育中的调控作用及调控网络提供重要基础信息。本文的主要内容及取得的主要研究结果如下：1．分别采集田间种植的小偃6号小麦品种的5叶期幼苗、孕穗期旗叶和开花后5天、10天及20天籽粒样品，提取各样品总RNA，分别构建5个样品的sRNA库。对5个sRNA库进行高通量深度测序和分析。结果表明：5个sRNA库所获得的干净sRNA序列数(clean reads)分别为幼苗13931738；旗叶13595341；5天籽粒14569411；10天籽粒14181881；20天籽粒18311762。测序所得数据已提交到NCBI GEO (GeneExpression Omnibus)数据库中，其登录号为GSE50524。对5个sRNA数据库中所有干净sRNA序列的长度分布分析发现，幼苗样品中75%以上的sRNA序列分布在20-24nt范围内；旗叶样品中，sRNA的分布主要集中的24nt、21nt和20nt；三个籽粒样品中24nt的sRNA的含量均占总sRNA的50%以上。对非冗余sRNAs(uniquesRNAs)序列分析表明5个sRNA库中24nt的sRNA均为主要种类（约为55%至70%），而20-23nt的sRNAs仅有3%至15%，这表明小麦不同器官中绝大多数sRNAs是与依赖于RNA的DNA甲基化和异染色质维持所介导基因沉默有关。此外，分析还发现小麦5个sRNA库中公共的21nt的sRNA不到1.2%，公共的24nt的sRNA不到0.4%；表明小麦不同器官或发育时期sRNA群体具有多样性，即小麦不同器官或不同发育时期有不同的sRNA群体发挥作用。将非冗余sRNAs与小麦基因组序列和小麦EST序列比对，结果能定位到小麦基因组shotgun组装序列的有55%的sRNA，能定位到小麦EST序列上的有28%的sRNA。对所得的sRNA进行了分类注释；其中的(来自miRBase中的非小麦)已知miRNA和未注释的sRNA序列将作为后续进行小麦known miRNA和novel miRNA鉴定的数据来源。2．通过生物信息学方法对上述5个小麦sRNA库分析和分类注释所得到的(来自miRBase中非小麦的)已知miRNA和未注释的sRNA序列进行小麦miRNA的识别鉴定；并对鉴定出的miRNAs在不同器官和不同发育时期的时空表达模式进行分析及miRNAs靶基因预测。结果表明，在5个小麦sRNA库中共鉴定出79条miRNA，包括24条已知miRNA和55条新miRNA。其中，本研究鉴定出的55条新miRNA存在于小麦基因组上的54个miRNA基因位点。我们已将这55条小麦新miRNA全部提交miRBase数据库(version21, June2014; http://www.mirbase.org），并已被全部收录。本研究鉴定出的24条已知miRNA（属于15个miRNA家族）存在于小麦基因组上的18个miRNA基因位点；其中9条（9个基因位点）miRNA是前人在miRBase/wheat中已注册的，其余15条（9个miRNA基因位点）是本研究首次在小麦中鉴定的已知miRNA。对已知miRNA家族进行保守型分析发现，13个（16个miRNA基因位点）属于高度保守的miRNA家族，2个（2个miRNA基因位点）属于中度保守的miRNA家族。采用研究报道提出的严格miRNA靶基因预测标准，对本研究鉴定出的已知miRNA和新miRNA进行靶基因预测，结果表明有15条已知miRNA和37条新miRNA预测得到靶基因的，且这些靶基因涉及的生物学功能比较广泛。3．为了分析本研究鉴定出的miRNA在小麦不同器官或发育时期的表达谱，作者首先从上述鉴定出的miRNA中随机选取9条（5条已知miRNA、3条新miRNA和1条候选miRNA），分析其在5个sRNA库中的丰度；并利用polyA qRT-PCR方法对这9条miRNA在所研究的这5个小麦器官或发育时期样品中的丰度进行定量分析，以验证高通量深度测序结果的可信性。结果表明实时定量测定得到的结果与sRNA库高通量测序所得结果呈极显著的相关性（相关系数为R2=0.892, P <0.01）；这证明本研究的小麦sRNA库测序结果是可靠的。作者然后利用5个sRNA库的测序数据分析了上述鉴定出的已知24条miRNA和55条新miRNA在这5个不同器官或发育时期的时空表达谱。结果表明：绝大多数miRNA(包括已知miRNA和新miRNA)都显示出不同程度的组织偏爱性表达；已知miRNA在5个不同样品中差异倍数的对数（log2）值为4.6~5.2；新miRNA在5个不同样品中差异倍数的对数值为8.6~7.6。4个已知miRNA家族（miR160、miR164、miR166和miR169）和22条新miRNA在籽粒中偏爱性表达的，其中有12条新miRNA在籽粒中特异表达，它们的差异倍数的对数值介于1.0~7.6之间。miR164和miR160的丰度在5天，10天，20天籽粒，依次升高，而miR169的丰度却依次降低，说明不同miRNA在籽粒发育各个阶段协调地发挥着不同的功能。籽粒中偏爱性表达的已知miRNA的靶基因预测结果显示出这些miRNA表达模式与其功能密切相关；这也暗示了在籽粒中偏爱性表达的22条新miRNA很可能参与小麦种子发育和代谢的调控。8个已知miRNA家族（miR156、 miR172、 miR168、miR396、miR159、miR398、miR1318和miR167）和28条新miRNA在旗叶中偏爱性表达，它们的差异倍数的对数值介于0.1~5.2之间。这些旗叶偏爱表达的miRNA的靶基因包括蛋白激酶,糖基转移酶,功能蛋白(Histone H2B.1)和一些酶，所有这些酶和蛋白都在信号传导和代谢中具有重要作用。旗叶偏爱性表达miRNA靶基因预测结果显示小麦旗叶miRNA参与的调控网络较籽粒miRNA更为复杂。4．为了鉴定小麦tasiRNA，本研究克隆了小偃6号小麦的TAS3a和TAS3b基因的部分序列，其长度分别为698bp和650bp；两条序列均包括完整的tasiRNA相位区。序列比对发现小麦TAS3基因在tasiRNA相位区的序列高度保守。将克隆得到的TAS3基因与构建的5个小麦sRNA数据库比对，共筛选到12条tasiRNA定位到TAS3a基因对应的相位上；13条tasiRNA定位到TAS3b基因对应的相位上。TAS3a基因共产生2条tasiRNA，其对编码生长素应答因子Auxin Response Factors（ARF）具有调控作用，故称为tasiARF，分别位于D6+和D7+相位上。TAS3a所产生的tasiRNA中，D6+相位产生的tasiARF在五个sRNA数据库中总丰度最高，其次为D4-相位产生的tasiRNA；TAS3b基因产生一条tasiARF，位于D4+相位上；该tasiRNA是TAS3b基因所产生的在5个样品中总丰度最高的tasiRNA，总丰度第二的是D7-相位产生的tasiRNA。来自小麦TAS3a的D4-相位上的和TAS3b的D7-相位上的tasiRNA的靶基因分别为抗性蛋白和冷响应蛋白。说明TAS3基因不但参与植物的生长调控还可能在植物抗逆过程中具有重要作用。5．另外，本研究还构建了小麦PDS（Phytoenedesaturase gene)基因的人工miRNA（amiRPDS），将其作为目的片段连接到BSMV载体上，构建成重组病毒BSMV-amiRPDS。用重组BSMV-amiRPDS侵染小麦后，小麦植株叶片产生光漂白斑现象。半定量PCR检测结果表明，内源PDS基因的转录物mRNA的积累量在发生光漂白的小麦叶片中显著降低。另外，将克隆得到的tae-miR156前体分别以正向和反向两种方式连接到BSMV载体上构建成重组病毒BSMV-miR156-F和BSMV-miR156-R。用重组BSMV-miR156-F和BSMV-miR156-R分别侵染小麦后，均导致小麦出现2种不同的表型：一种表型是小麦只进行营养生长，一直不抽穗；另一种表型是小麦可以抽穗，但是抽穗时间比对照植株（用BSMV侵染的小麦植株）推迟7-10天。实时定量PCR检测表明，具有这两种表型的植株中tae-miR156的丰度与对照株相比较均有显著的升高（P≤0.05）；并且，BSMV-miR156-F转染植株miR156丰度增大值显著高于转染BSMV-miR156-R转染的植株的。由此说明BSMV-miR156-F更适用于小麦miR156过表达的功能研究。上述研究结果丰富miRBase中小麦miRNA的信息，揭示了这些小麦miRNA的时空表达特征，为进一步研究miRNA在小麦生长、发育，尤其是在旗叶和籽粒生长发育中的调控作用及调控网络提供了重要信息。