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目的:乙醇(酒精)是目前世界上最滥用的物质之一,导致的社会问题也日俱严重[1]。目前的研究已经表明乙醇能导致大脑皮层、海马及小脑神经细胞变性、萎缩、凋亡及抑制神经细胞的分化[2,3]。孕妇酗酒导致的胎儿酒精综合征是乙醇对中枢神经系统的损害中的严重后果,其损害包括诱导神经退行性变,促进神经细胞凋亡及变性坏死,对神经细胞的分化、迁移造成影响等病理性改变。在中枢神经系统的发育过程中,几乎每个神经细胞都要经历分化迁移的过程,到达它们发挥功能的部位,神经细胞在分化迁移过程中出现异常,就可能导致很多原发性神经疾病的发生。迄今为止的研究虽然表明乙醇可能对神经细胞的分化迁移造成影响,但造成影响的机制及参与影响分化迁移的基因蛋白,目前国内外无详细报道,本研究设计采用体外细胞实验及整体实验,系统观察在乙醇的毒性作用下,与神经细胞分化迁移密切相关的神经细胞微管相关蛋白2(microtubeasso ciated protein-2, MAP2)、拓扑异构酶Ⅱ β (DNA topoisomere Ⅱ β, TopⅡ β)、孤儿核受1(nuclearreceptor-related factor1NURR1)的表达变化,旨在探明MAP2、TopⅡ β、NURR1是否参与了乙醇导致的神经细胞分化异常,为神经细胞分化异常导致的病理状态的防治,提供科学依据。方法:1原代培养新生鼠大脑皮层细胞:取新生鼠(出生24h内),75%酒精消毒,断头取脑,剖开头骨暴露大脑半球,放于D-Hanks液中(所有操作于冰上),解剖镜下去脑膜,沿中线将大脑半球往外翻开,用纤维镊小心分离大脑皮层组织,用眼科无齿镊小心剥去脑膜及血管后将大脑皮层组织移至一干净的培养皿中,加入0.125%的胰蛋白酶消化液3ml剪碎,消化30min,将消化好的细胞碎片移入离心管中,加入种植培养液(含10%胎牛血清的DMEM培养基)终止胰酶作用,5min,重复2次。用分别套有蓝枪头和黄枪头的玻璃吸管吹打成单细胞悬液,再分别用100目、200目铜筛滤过,细胞计数器进行活细胞计数,按1×106个/ml种植于24孔板中,每孔加入500μl,放入37℃、5%CO2的孵育箱中孵育2小时后,换成NEUROBASAL培养基+B27按50:1配制的培养基,以后每两天换一次培养基。给予剂量75mM的乙醇培养3d、5d、7d后,采用免疫荧光观察MAP2、TopⅡ β、NURR1蛋白表达情况;Fluoro-Jade B荧光染色观察神经细胞变性坏死情况。2整体动物模型:健康Wistar孕鼠,体重260±10g。随机分为空白对照组及灌酒组。用市售白酒红星二锅头5g/kg量制备模型,采用大鼠灌胃器进行灌胃,每天2次,间隔12小时。空白对照组用蒸馏水代替白酒灌胃。实验前给予适应性蒸馏水灌胃5天。从怀孕第6天起开始酒精灌胃,直到孕鼠分娩后,取新生鼠3天、7天、13天大脑各6只及空白对照组3天、7天、13天各6只经固定、脱水、透明、包埋、切片等处理后经免疫组织化学染色观察大脑皮层神经细胞的变化。3统计学分析:数据以“均数±标准差(Mean±SD)”表示,用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,各组均数的比较行单因素方差分析(ANOVA),用最小显著差法(least significant difference,LSD)作两两比较,以P<0.05为有显著统计学差异。结果:1细胞实验(新生鼠大脑皮层原代培养)1.1乙醇对MAP2、TopⅡ β、NURR1表达的影响随着乙醇染毒时间的延长,MAP2的表达呈现减少趋势,染毒7天时变化最显著,与正常对照组相比细胞分布较稀疏,突触明显细而短,细胞胞浆内红色荧光信号减弱明显,阳性表达明显减少;TopⅡ β、NURR1的表达均随染毒时间的延长而减少。1.2Fluoro-Jade B染色观察神经细胞变性坏死情况正常对照组原代培养神经细胞,未见变性坏死阳性细胞;乙醇染毒培养5d组偶见变性坏死阳性细胞,7d组见散在变性坏死阳性细胞2整体动物实验(孕期灌酒组新生鼠)2.1MAP2免疫组织化学染色结果新生鼠大脑皮层神经细胞胞浆及突触中可见棕褐色颗粒样的MAP2阳性表达,灌酒组新生鼠生后不同时间大脑皮层阳性表达与正常组相比呈下降趋势。2.2TopⅡ β及NURR1免疫组织化学染色结果新生鼠大脑皮层神经细胞胞核可见明显棕褐色阳性表达,灌酒组新生鼠生后不同时间大脑皮层阳性表达与正常组相比呈下降趋势。结论:乙醇的神经毒性作用使MAP2、Top Ⅱβ、NURR1表达降低,提示乙醇影响了神经细胞的分化,导致神经细胞突触免疫活性下降,造成微管性堆积,影响了细胞骨架的完整,最终导致了神经细胞的变性坏死。