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研究背景和目的RNA干扰(RNA interference, RNAi)是由dsRNA介导的特异性基因沉默现象,能快速便捷的对基因的功能进行分析。它能在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。RNAi作为一种强大的基因沉默技术,具有高效性和高特异性等特点。尽管RNAi已经广泛应用于基因治疗,特别是在病毒感染,肿瘤治疗和遗传性疾病等方面。但目前越来越多的研究表明RNAi可以引发脱靶效应(off-target effects),如：非靶基因的抑制,干扰素反应的激活和细胞内沉默机器的饱和。这将严重影响RNAi技术的应用前景。已经知道大约90%的人类肿瘤细胞存在端粒酶逆转录酶(hTERT human telomerase reverse transcriptase)活性,而在正常细胞中检测不到端粒酶逆转录酶的活性。因此hTERT被认为是广谱的肿瘤性标志。本课题中我们利用端粒酶逆转录酶启动子(htert promoter)的肿瘤特异性特异性建立一种特异性表达siRNA的系统,将siRNA表达局限在肿瘤细胞中,而在正常细胞中不表达。这将为RNAi的基因治疗奠定基础。我们又进一步构建了表达靶定端粒酶逆转录酶的小RNA的重组质粒,研究siRNA-telomerase对HeLa细胞生长的影响。方法构建pShuttleA-htertp-siRNA-GFP表达载体,将其转染宫颈癌细胞HeLa,通过RT-PCR方法,验证siRNA-GFP在肿瘤细胞的表达。我们又将pShuttleA-htertp-siRNA-GFP表达载体与表达绿色荧光蛋白质粒pCDNA3.1/EGFP共转染宫颈癌细胞HeLa,人胚肾细胞HEK293和人正常成纤维细胞BJ,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达量的变化。构建表达pShuttleA-htertp-siRNA-telomerase质粒,转染人宫颈癌HeLa细胞,通过软琼脂克隆形成实验和平板克隆形成实验,观察其对细胞生长的影响。结果在转染了pShuttleA-htertp-siRNA-GFP的HeLa细胞中,通过RT-PCR可以检测到大约70bp的siRNA-GFP的表达,而在转染了对照质粒的细胞中,检测不到siRNA-GFP的表达。通过荧光显微镜观察到在共转染了表达载体pShuttleA-htertp-siRNA-GFP和质粒pCDNA3.1/EGFP的HeLa细胞和HEK293细胞中荧光表达量明显下降,蛋白表达量的抑制率分别为69%和75%。而正常细胞BJ中的荧光表达量没有变化。软琼脂克隆形成实验和平板克隆形成实验表明,转染了质粒pShuttleA-htertp-siRNA-telomerase的HeLa细胞,其细胞生长明显受到抑制,抑制率为42.9%。结论我们发现构建含hTERT启动子的siRNA表达载体在肿瘤细胞中能特异性表达,并有效的发挥干扰作用,而在正常人成纤维细胞BJ中不表达。利用重组质粒pShuttleA-htertp-siRNA-telomerase封闭了HeLa细胞内hTERT的表达后,能特异性抑制细胞的生长。