中药地黄(Rehmannia glutinosa,RG)是玄参科植物地黄的根,早在汉代医学典籍《神农本草经》中就有记载。诸多临床和实验研究表明,地黄对血液系统、免疫系统、内分泌系统、心血管系统和神经系统等等均具有一定的影响。随着近年来对地黄药理学功能的研究日益深入,我们发现地黄多糖(Rehmannia glutinosa polysaccharide,RGP)是地黄发挥免疫增强作用的主要活性成分。这对于现代免疫佐剂研究具有重要价值。然而另一方面,地黄多糖存在着大分子多糖的普遍存在的缺陷,即在体内代谢快,作用时间短,作用范围不集中,临床用量大等等。本研究着眼于提高地黄多糖的生物利用率,更好地发挥其增强免疫之药效,以更好地为其在临床推广应用服务。脂质体(liposome)由一层或者多层磷脂分子层包裹着一个水相的核心而形成一种人工合成的微囊泡。一种或多种药物成分可以包裹在脂质体水相闭合囊泡内或者修饰在其膜上。脂质体作为一种新型药物传输载体和前景广阔的免疫佐剂,在过去的数十年里备受瞩目。脂质体能够将药物输送到特定部位从而能够药效,提高药物的生物利用率;还能够控制药物释放速率,从而降低药物毒副作用改善患者的依从性。本研究将脂质体作为载体,选用逆相蒸发法法将地黄多糖包埋其中,制得地黄多糖脂质体(Rehmannia glutinosa polysaccharide liposome,RGPL),并通过响应面法对制备工艺进行优化;通过一系列体内和体外试验,探究RGPL对试验动物体内淋巴细胞增殖,血清抗体效价,血清中细胞因子水平以及体外对小鼠腹腔巨噬细胞和小鼠骨髓来源的树突状细胞等免疫指标的影响,旨在探索研制一种新型安全有效的免疫增强剂。本试验分为以下七个部分:试验I地黄多糖体外对小鼠淋巴细胞及树突状细胞活性的影响本试验旨在探究地黄多糖的免疫增强活性作用。首先采用了 MTT法检测了不同浓度的地黄多糖对小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响;然后用EL IS A法检测了不同浓度的地黄多糖对T细胞分泌的细胞因子的影响;最后测定了地黄多糖对树突状细胞功能的影响。试验结果表明,浓度在12.5-200ug.mL-1的地黄多糖能显著促进小鼠脾脏混合淋巴细胞的增殖;在12.5-100ug.mL-1浓度范围时,对于B淋巴细胞的促增殖作用显著优于LPS对照组;在12.5-200ug.mL-1浓度范围对于T淋巴细胞的促增殖作用显著优于PHA对照组。地黄多糖单独作用下的T淋巴细胞,IL-2和IFN-γ的分泌量显著增加。浓度为100 ug.mL-1时,T细胞分泌的IL-2含量显著高于细胞对照组。25-200 ug·mL-1浓度范围内,T淋巴细胞分泌的IFN-γ含量均显著高于细胞对照组。浓度为100ug·mL-1地黄多糖协同PHA作用下的T淋巴细胞分泌的IL-2含量显著高于PHA对照组,浓度为25ug·mL-1时,T细胞分泌的IFN-γ含量显著高于PHA对照组。此外,50-100ug·mL-1浓度范围内的地黄多糖能显著增强树突状细胞促T淋巴细胞增殖的作用,以及树突状细胞的抗原提呈作用。进而得出,地黄多糖具较强的免疫增强活性,为进一步研究提供理论参考。试验Ⅱ地黄多糖脂质体制备工艺的优化本试验旨在筛选出制备地黄多糖脂质体(RGPL)的最佳方法和最佳条件。首先采用四种不同制备方法制备地黄多糖脂质体,经比较四种不同制备方法,选择逆相蒸发法作为制备RGPL的最适方法。借由脂药比、膜材比、磷脂与吐温80质量比、磷脂与氯仿甲醇体积和之比、氯仿甲醇体积比和旋转蒸发的温度这六个单因素试验,得到对制得的RGPL包封率影响较大的四个单因素,即:膜材比、氯仿甲醇体积比、磷脂与吐温80质量比和旋转蒸发温度。进一步通过响应面法对制备条件进行了科学合理的优化,得到最优的条件组合。试验结果显示,最优制备工艺是:磷脂:胆固醇为8:1,氯仿:甲醇为3:5,磷脂:吐温80为10:1,旋转蒸发温度为66℃,在该条件下制得的脂质体包封率为72.753 ± 0.318%。试验Ⅲ地黄多糖脂质体质量评价本试验对在最佳制备工艺条件下制得的RGPL进行了形态学、粒径等理化性质进行了研究,并考察了其释放规律,综合评价制得的脂质体质量。结果表明制得的RGPL粒径仅为118nm,且较粒径均一,并且,体外具有良好的控制释放功能。试验IV地黄多糖脂质体对鸡新城疫疫苗免疫应答的影响本试验旨在探究地黄多糖脂质体对鸡新城疫疫苗免疫应答的影响。七组14日龄蛋公鸡经新城疫IV系苗以滴鼻、点眼的方式进行首次免疫,并在28日龄进行二免。在首免的同时,分别肌肉注射高、中、低剂量的RGPL,RGP和空白脂质体,只免疫组和空白对照组(注射等量PBS),隔离饲养。于首免后第7、14、21、28、35、42d心脏和翼静脉采血,采用β-微量法测定血清HI抗体效价的动态变化;MTT法测定外周血T淋巴细胞增殖情况。RGPL高、低两个剂量组的鸡血清抗体效价在所有检测时间点均显著高于免疫对照组,且能一直保持较高抗体水平。RGPL高中低三个剂量组在2-4周对外周血中淋巴细胞的促增殖作用显著优于免疫组。