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刺激隐核虫(Crytocaryon irritans)是可感染所有海水硬骨鱼类的原生寄生虫,能造成养殖鱼类的大量死亡。黄斑篮子鱼(Siganus oramin)对刺激隐核虫感染有很强的抵抗力,其血清对该寄生虫具有杀灭作用,血清中具有抗虫蛋白L-氨基酸氧化酶(LAAO)。然而,篮子鱼对刺激隐核虫感染的抗病生物学特性尚不清楚,为阐明篮子鱼抗刺激隐核虫感染的机制,为刺激隐核虫病的防控提供思路,本文研究了篮子鱼感染刺激隐核虫后的应激反应和免疫反应、篮子鱼对刺激隐核虫发育的影响及探讨了网箱养殖中刺激隐核虫的来源,主要研究结果如下:(1)篮子鱼对刺激隐核虫感染的应激反应为了揭示刺激隐核虫感染对篮子鱼造成的应激反应,通过比较篮子鱼和易感宿主大黄鱼(Larimichthys crocea)感染刺激隐核虫后的存活率和摄食量,测定篮子鱼感染后组织的酶活(SOD、CAT、Na+/K+ATPase和Ca2+/Mg2+ATPase)和LAAO基因表达变化发现:篮子鱼感染后的摄食量仅在第1天下降14.6%,第2天恢复正常且自然重复感染对其摄食没有影响,而大黄鱼感染后第3天停止摄食并在自然重复感染时全部死亡;篮子鱼感染后肝脏SOD和CAT活性仅分别在第48 h和第6 h显著上升,鳃中无显著变化;鳃的Na+/K+ATPase和Ca2+/Mg2+ATPase活性只在第12和24 h显著下降,肝脏中无显著变化,说明了刺激隐核虫感染对篮子鱼造成的损伤是轻微且短暂的;qRT-PCR检测发现篮子鱼LAAO在各组织中均有表达,在免疫组织中表达较高,感染刺激隐核虫早期篮子鱼鳃和脾的LAAO基因表达量显著上调,其可能参与宿主对寄生虫感染的早期防御。(2)篮子鱼对刺激隐核虫感染的免疫反应特性大部份刺激隐核虫在感染篮子鱼早期已被驱离,为研究其能否诱导篮子鱼产生免疫反应。本试验分析了刺激隐核虫感染第12 h的篮子鱼皮肤转录组学并评估了篮子鱼浸泡免疫后第4周的保护力。转录组测序共获得238,504,124条高质量reads,拼接得到258,869条unigene,平均长度为621 bp,N50为833 bp。感染组和对照组的转录组比较发现418个差异表达基因(DEGs),其中336个显著上调,82个显著下调。通过GO富集和KEGG通路分析,共筛选得到32个免疫相关的DEGs,包含了先天免疫因子(如LAAO、抗菌肽和溶菌酶)、补体、趋化因子及其受体、NOD-like/Toll-like受体信号通路分子、抗原呈递和T/B细胞活化增殖分子等。刺激隐核虫浸泡免疫后第4周的攻毒结果显示,免疫组的死亡率和相对感染强度显著低于对照组。以上结果表明篮子鱼依赖于先天免疫抗御刺激隐核虫感染,获得性免疫能进一步加强抗御能力。(3)篮子鱼LZMg和NK-lysin基因的克隆及原核表达转录组数据显示,感染刺激隐核虫后篮子鱼的g型溶菌酶(LZMg)和抗菌肽NK-lysin呈显著上调。为了解篮子鱼LZMg和NK-lysin基因序列特征及其在刺激隐核虫感染后的表达变化,本试验克隆了LZMg和NK-lysin基因序列。篮子鱼LZMg ORF长度为567 bp,编码188个氨基酸,含有1个Pfam结构域和3个保守的催化位点,其氨基酸序列与鲈鱼(Dicentrarchus labrax)具有最高相似性,在进化树中与大黄鱼聚在一支。篮子鱼NK-lysin ORF长度为450 bp,编码149个氨基酸,具有SAPLIP家族的特征:含有4个保守的半胱氨酸和Saposin B蛋白结构域,与条石鲷(Oplegnathus fasciatus)的相似性最高。qRT-PCR检测结果显示,LZMg和NK-lysin在各组织中均有表达,肝脏、血液、心脏和脾脏表达较高,刺激隐核虫感染后鳃和脾脏中的LZMg和NK-lysin均出现显著上调。(4)刺激隐核虫在篮子鱼上发育过程观察为了阐明篮子鱼对刺激隐核虫发育的影响,通过比较篮子鱼和大黄鱼感染刺激隐核虫后的不同时间点鳃的滋养体数量、脱落的包囊数量、包囊特征和虫子繁殖率,并利用扫描电镜观察刺激隐核虫细胞显微结构。结果显示,感染刺激隐核虫后,篮子鱼鳃的滋养体数量在第6 h开始显著下降,且18 h内脱离的滋养体不能形成包囊,而大黄鱼鳃的滋养体数量在0–72 h没有显著的变化。从篮子鱼脱离形成的包囊能正常分裂,包囊孵出的幼虫毒力不变。扫描电镜结果显示刺激隐核虫在篮子鱼形成的滋养体、包囊前体和包囊具有正常的细胞形态,但在鱼体寄生时长一样,篮子鱼脱落形成的包囊小于大黄鱼的。刺激隐核虫寄生于大黄鱼的繁殖率高达59倍,而篮子鱼只有0.08倍。结果表明篮子鱼能在刺激隐核虫寄生的早期阶段驱除刺激隐核虫并限制其发育,从而避免寄生造成的损伤和重复感染。(5)网箱养殖中刺激隐核虫来源的初步研究以往研究认为,刺激隐核虫包囊在深海难以孵化,致使包囊在海底大量累积,在台风等作用下卷入浅海才能爆发,本实验将包囊分别放置于淤泥、深度2 m、10 m和30 m的海水中,研究其第3天和第6天孵化情况,发现淤泥和30 m的海水深度虽然对包囊分裂速度有一定的延缓作用,但对包囊的存活和孵化率没有影响,这表明包囊难以在海底累积,即海底虫源数量不会对造成鱼死亡。网箱网衣上易长附着生物,为研究刺激隐核虫包囊是否粘附于网衣附着物上,本试验将网衣置于患刺激隐核虫病的大黄鱼的桶底,统计网衣上包囊的附着情况。结果显示,包囊可以附着在网衣上,且网衣附着物越多,包囊附着率越高,最高可达17.3%。以上结果表明刺激隐核虫包囊可以粘附于网箱网衣,是养殖鱼类的重要感染源。