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热纤梭菌(Clostridium thermocellum)是一种厌氧嗜热菌,其产生的β-1,4-内切葡聚糖酶具有耐热特性。本研究克隆了热纤梭菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因celD,采用大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115对其进行表达,并对表达产物的活性和酶学特性进行了系统性分析。主要研究结果如下:以提取的热纤梭菌基因组为模板,利用TD-PCR技术克隆了热纤梭菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因celD,并构建了重组质粒pGEM-T Easy TCE Vector。测序表明,其长度为2058 bp,ORF为1947 bp,编码649个氨基酸,5’端有一个编码41个氨基酸的信号肽序列,其全长理论分子量为72.4 kDa。通过带限制性内切酶位点的引物(5TCE带EcoR I位点,3TCE带Not I位点),将热纤梭菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因celD定向插入到原核表达载体pET-30a(+)上,得到重组表达质粒pET-30a(+)TCE Vector。在大肠杆菌BL21(DE3)中得以表达,SDS-PAGE凝胶电泳显示在77 kDa左右处有一特异的融合蛋白条带。单位发酵液的酶活力为22 U/ml。根据酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点和已克隆的β-1,4-内切葡聚糖酶基因celD限制性内切酶图谱,将热纤梭菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因celD以N-端融合的方式正确插入到酵母表达载体pPIC9K上的α—因子信号肽编码序列的3’端,构成重组表达载体pPIC9K-TCE。用电击法将经BglⅡ单酶切线性化的pPIC9K-TCE转化入毕赤酵母GS115菌株,从而整合到酵母染色体DNA中得到重组转化子。筛选到的基因工程菌经培养后,上清液的发酵活力为8 U/ml,SDS-PAGE凝胶电泳检测,表达的β-1,4-内切葡聚糖酶的分子量约为72 kDa,这表明β-1,4-内切葡聚糖酶基因celD在毕赤酵母得到了表达。对两种表达系统的表达的β-1,4-内切葡聚糖酶生物学特性研究显示,E.coliTCE菌株与Pichia pastoris TCE9K菌株表达的热纤梭菌β-1,4-内切葡聚糖酶具有差异,最适反应温度均为50℃和60℃。重组β-1,4-内切葡聚糖酶在70℃2min处理后的残余酶活可高达67%。其最适反应pH为6,pH稳定性较好。