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热纤梭菌(Clostridium thermocellum)是一种厌氧嗜热菌，其产生的β-1，4-内切葡聚糖酶具有耐热特性。本研究克隆了热纤梭菌β-1，4-内切葡聚糖酶基因celD，采用大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115对其进行表达，并对表达产物的活性和酶学特性进行了系统性分析。主要研究结果如下：以提取的热纤梭菌基因组为模板，利用TD-PCR技术克隆了热纤梭菌β-1，4-内切葡聚糖酶基因celD，并构建了重组质粒pGEM-T Easy TCE Vector。测序表明，其长度为2058 bp，ORF为1947 bp，编码649个氨基酸，5’端有一个编码41个氨基酸的信号肽序列，其全长理论分子量为72.4 kDa。通过带限制性内切酶位点的引物(5TCE带EcoR I位点，3TCE带Not I位点)，将热纤梭菌β-1，4-内切葡聚糖酶基因celD定向插入到原核表达载体pET-30a(+)上，得到重组表达质粒pET-30a(+)TCE Vector。在大肠杆菌BL21(DE3)中得以表达，SDS-PAGE凝胶电泳显示在77 kDa左右处有一特异的融合蛋白条带。单位发酵液的酶活力为22 U／ml。根据酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点和已克隆的β-1，4-内切葡聚糖酶基因celD限制性内切酶图谱，将热纤梭菌β-1，4-内切葡聚糖酶基因celD以N-端融合的方式正确插入到酵母表达载体pPIC9K上的α—因子信号肽编码序列的3’端，构成重组表达载体pPIC9K-TCE。用电击法将经BglⅡ单酶切线性化的pPIC9K-TCE转化入毕赤酵母GS115菌株，从而整合到酵母染色体DNA中得到重组转化子。筛选到的基因工程菌经培养后，上清液的发酵活力为8 U／ml，SDS-PAGE凝胶电泳检测，表达的β-1，4-内切葡聚糖酶的分子量约为72 kDa，这表明β-1，4-内切葡聚糖酶基因celD在毕赤酵母得到了表达。对两种表达系统的表达的β-1，4-内切葡聚糖酶生物学特性研究显示，E．coliTCE菌株与Pichia pastoris TCE9K菌株表达的热纤梭菌β-1，4-内切葡聚糖酶具有差异，最适反应温度均为50℃和60℃。重组β-1，4-内切葡聚糖酶在70℃2min处理后的残余酶活可高达67％。其最适反应pH为6，pH稳定性较好。