黔产苦参的质量评价研究

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目的:对贵州不同产地苦参进行生药学相关方面研究,分析苦参中苦参总碱与不同环境因素之间相关性,及不同产地苦参遗传变异性,为苦参质量评价和人工栽培提供依据。方法:通过原植物、性状显微鉴定、药材的常规检查、含量测定、DNA分子遗传标记和苦参遗传变异,对黔产苦参进行生药学方面相关研究。采用水合氯醛透化法制作根粉末临时装片;紫外-分光光度法测定苦参总碱含量;采用高效液相色谱法分别测定苦参碱和氧化苦参碱的含量;经典的CTAB法提取苦参叶片DNA;针对Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA和Taq DNA聚合酶这五个因素进行正交设计L16(45),优化黔产苦参ISSR-PCR反应体系,并对不同产地扩增条带进行聚类分析。结果:显微结构与文献报道一致;从整体情况来看,不同生态环境因素黔产苦参中苦参总碱含量差异较大,苦参中苦参总碱的含量与海拔高度和年平均降雨量有直接相关性,苦参中苦参总碱含量与年平均温度和年平均日照量无直接相关性;苦参碱在0.0150~0.1200μg范围内与峰面积成线性关系(r=0.9995),氧化苦参碱在0.0585~0.8395μg范围内与峰面积成线性关系(r=0.9990);苦参碱平均加样回收率为96.67%,RSD=1.65%(n=9),氧化苦参碱平均加样回收率为98.46%,RSD=1.13%(n=9)。经典CTAB法提取苦参DNA纯度和浓度较高,显示25μL最适ISSR-PCR反应体系:模板DNA 90ng、0.4μmoL·L-1引物、2.0 mmoL·L-1 Mg2+、Taq DNA聚合酶0.5 U、0.5 mmo L·L-1dNTPs,16个居群苦参相似系数在0.00~0.49之间,聚成3大类群。结论:海拔高度和年平均降雨量对黔产苦参中苦参总碱含量有显著性影响,年平均温度和年平均日照量对其无显著性影响,为苦参科学人工栽培提供实验依据;在所有样品中,除贵州省毕节市、贵阳市金阳新区和黔东南州黎平县外,其余采样区都符合2010年版《中国药典》规定标准,苦参碱和氧化苦参总量不少于1.2%,凯里市麻江县和贵阳市开阳县苦参资源质量较好;CTAB法适合黔产苦参DNA提取,建立苦参ISSR-PCR反应体系,经过16份苦参样品检验,证明该体系稳定可靠,可用于苦参遗传多样性分析,贵州几个产地苦参有一定遗传变异性。
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