论文部分内容阅读
前列腺癌(PCa)是多发于老年男性的恶性肿瘤,随着其发病率的增高,特别是激素非依赖性前列腺癌(AIPC)治疗效果和疾病预后的不佳,对PCa发生发展机制的研究日趋受到人们关注。本论文分为三个部分。第一部分主要就PTEN基因在PCa的表达及其与雄激素受体(AR)表达的相关性作探讨和分析。PTEN基因是继p53之后的又一抑癌基因,具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶双重活性,其表达缺失与多种恶性肿瘤的发生有关,包括PCa。PCa组织中PTEN基因表达情况的检测对PCa发生机制的研究及其预后判断具有重要价值。与此同时,AR在维持前列腺的生长发育、正常功能发挥以及前列腺增生症(BPH)、PCa的发生发展过程中具有重要作用。我们经超声引导下穿刺取材,对41例病理诊断PCa的病灶组织和30例病理诊断BPH的病灶组织,通过RT-PCR方法检测穿刺取材组织的PTEN和AR表达,并经Western blot方法验证,分析PTEN和AR的表达与PCa临床分期、Gleason评分(病理分级)的关系以及PTEN与AR表达的相关性,旨在研究PTEN和AR的表达与PCa病程进展的关系以及二者在PCa中表达的相关性。结果显示,与BPH比较,各临床分期的PCa组织中PTENmRNA和PTEN蛋白表达显著降低(P<0.01),且PTENmRNA和PTEN蛋白表达随临床分期的增高呈负相关(r分别为-0.997和-0.710,P<0.01)；高、中分化组(Gleason评分S7)和低分化组(Gleason评分≥8)的PTENmRNA和PTEN蛋白的表达均显著降低(P<0.01),且随Gleason评分(病理分级)的增高呈负相关(r分别为-0.672和-0.409,P<0.01)。ARmRNA和AR蛋白的表达在PCa早期高于BPH (P<0.01),随肿瘤临床分期的增高呈显著降低(P<0.01),且ARmRNA和AR蛋白的表达与PCa临床分期呈负相关(r分别为-0.785和-0.860,P<0.01)；ARmRNA和AR蛋白在高、中分化组(Gleason评分夕)PCa中的表达显著高于低分化组(Gleason评分>8)(P<0.01),而在低分化组(Gleason评分>8)的表达显著降低(P<0.01),ARmRNA和AR蛋白的表达与Gleason评分(病理分级)呈负相关(r分别为-0.560和-0.709,P<0.01)。在PCa临床分期增高的进程中,PTENmRNA与ARmRNA的表达、PTEN蛋白与AR蛋白的表达存在相关性(r分别为0.641和0.557,P<0.01)。根据以上结果我们认为,随着PCa临床分期、Gleason评分(病理分级)的增高,PTEN与AR的表达呈显著减低,二者表达具有相关性。第二部分主要内容是PTEN基因对PC3细胞Rafl磷酸化负调控作用的实验研究。PTEN基因的抑癌作用以及AR在PCa特别是AIPC发生中的作用与多个细胞转导信号通路有关,如PI3K/AKT、MAPK/ERK等。PTEN和AR可通过对信号通路中的信号蛋白磷酸化的促进和抑制来发挥作用,而信号通路中的各信号蛋白又经通路内部以及信号通路间的相互作用完成调控效应,观察PTEN对信号通路中关键环节的作用有助于揭示AIPC发生机制的分子生物学基础。PTEN对PI3K/AKT信号通路中AKT的作用较为明确,而PTEN在MAPK/ERK信号通路中除Ras、MEK、ERK外是否存在其他的作用点,是我们本部分研究的重点。根据MAPK/ERK信号通路的作用特点,我们选定通路中的信号蛋白Rafl作为研究对象,在FTS (150μmol/L)抑制Ras活性、MK2206 2HC1(3μmol/L)抑制AKT活性处理的PC3细胞中观察PTEN表达变化的状态下磷酸化Raf1的表达变化,旨在揭示PTEN基因表达变化对Raf-1磷酸化的影响。实验结果显示,PTEN过表达状态下磷酸化Rafl明显减少(P<0.01),灰度分析表明,PTEN过表达后磷酸化Raft减少61.1%(P<0.01)；干扰PTEN的状态下磷酸化Raft明显增加(P<0.01),灰度分析表明,干扰PTEN使其表达降低后磷酸化Raf-1增加75.1%(P<0.01)。本研究提示,PTEN某因表达前列腺癌PC3细胞Raf1磷酸化呈负相关关系,Raf1是PTEN在MAPK/ERK信号转导通路中除Ras、MEK、ERK以外新的作用位点。本研究有助于揭示前列腺癌的发生机制并可针对PTEN、Rafl以及MEK等信号通路中关键信号蛋白作为靶点进行治疗干预。第三部分的主要内容是PTEN基因通过负调控Raf1磷酸化,调节凋亡蛋白进而影响PC3细胞凋亡的实验研究。细胞凋亡是细胞重要的生理功能之一,是由基因调控的细胞主动死亡的过程。细胞凋亡不仅在维持机体细胞增殖与生存的动态平衡中具有重要作用,同时也对肿瘤的发生发展产生影响。PTEN基因能负调控MAPK/ERK信号通路中Raf1的磷酸化,进而可影响MEK1/2、ERK1/2的活性。而MAPK/ERK信号通路可经相关的途径作用于细胞凋亡的过程。我们在PTEN基因负调控Rafl磷酸化的基础上,经FTS (150pmol/L)抑制Ras活性、MK2206 2HC1(3μmol/L)抑制AKT活性,观察PTEN基因表达变化引起Rafl磷酸化改变的同时对PC3细胞凋亡的影响。实验结果显示,PTEN基因过表达时,磷酸化Raft表达减低,光镜下PC3细胞出现凋亡的形态改变,CCK-8检测的细胞活力为(49.60+0.52)%,细胞活力较对照组减低(P<0.01),流式细胞仪检测PC3细胞凋亡率为(25.07+0.25)%,细胞凋亡率较对照组增加(P<0.01),同时凋亡蛋白caspase-8、caspase-9、caspase-12、caspase-3和促凋亡蛋白Bax呈高表达,而抗凋亡蛋白Bcl-2则呈低表达(P<0.01)；对PTEN基因进行干扰后,PTEN表达减低,磷酸化Raf1表达增加,CCK-8检测的细胞活力为(113.45±1.16)%,细胞活力较对照组增高(P<0.01),流式细胞仪检测PC3细胞凋亡率为(0.133±0.058)%,细胞凋亡率较对照组减低(P<0.01),同时检测到凋亡蛋白caspase-8、caspase-9、caspase-12、caspase-3和促凋亡蛋白Bax的表达减低,而抗凋亡蛋白Bcl-2则呈高表达(P<0.01)。本研究提示,PTEN基因可通过负调控磷酸化Raf1调节MAPK/ERK信号通路活性,进而影响PC3细胞的凋亡。针对包括Raf1在内的MAPK/ERK信号通路的关键信号蛋白以及细胞凋亡的核心因子,如caspase家族、Bcl-2/Bax等,可为研究PCa以及AIPC的诊断和治疗新靶点提供分子生物学理论基础。