论文部分内容阅读
目的:本研究主要通过药物WP1066及基因沉默技术利用STAT3短发夹RNA( STAT3-shRNA)对人脑胶质瘤细胞U251及A172细胞系STAT3通路的抑制,探讨STAT3基因对于U251及A172细胞凋亡、自噬及放射敏感性的影响及其作用机制。 方法:(一)、X射线对U251细胞凋亡、自嚼及STAT3蛋白磷酸化水平的影响:1、western blot方法验证4、8GyX射线对U251细胞凋亡、自噬相关蛋白以及P-STAT3蛋白的影响;2、GFP-LC3法检测X射线对U251细胞自噬凝集簇形成的影响;(二)、抑制STAT3通路对脑胶质瘤细胞放射敏感性的影响及其机制:1、Western blot法检测WP1066及STAT3-shRNA对U251细胞STAT3蛋白水平抑制效果;2、克隆形成实验检测抑制STAT3通路及联合X线照射的U-251细胞克隆形成率;3、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记染色法(TUNEL)及流式细胞技术检测抑制STAT3对U251细胞的凋亡影响;4、GFP-LC3质粒转染观察抑制STAT3对 U251细胞自噬凝集簇形成的影响。(三)、抑制自噬联合下调STAT3通路对脑胶质瘤放射敏感性的影响及其机制:釆用药物3-M A及A T G5小干扰RNA(siATG5)抑制自噬,采用克隆形成实验方法检测U251、A172细胞克隆形成率,Annxin V-P E流式细胞技术检测上述处理后的细胞调亡;Western blot法分析调亡相关蛋白caspase3、cleaved caspase3、PARP1、cleaved PARP1和自唆相关蛋白LC3B、ATG5、beclin1表达的变化。 结果:(一)、X射线在0、4、8Gy剂量范围内可诱导细胞凋亡、自噬以及STAT3蛋白磷酸化水平的上调,在该剂量范围内具有一定的剂量依赖作用。(二)1、MTT结果显示0.5~1 pM WP1066对U251细胞无明显毒性作用,同时成功设计并转染STAT3-shRNA, Western blot结果显示1|liM WP1066及STAT3-shRNA-4对p-STAT3抑制效果明显,因此选择1 HMWP1066及STAT3-s_A-4作为后续实验研究;2、克隆形成实验结果显示:U251单纯照射组和照射联合W1066组的平均致死剂量(DO)分别为2.36Gy和1.97Gy,准域剂量Dq分别为l.O lGy和0.93Gy,WP1066对U251细胞的放射增敏比(SER)1.20,空载组与shSTAT3组DO分别为2.76Gy和2.32Gy, Dq分别为0.64Gy和0.50Gy,SER为1.19;3、凋亡相关实验:Annexin V-PE 流式细胞检测及TUNEL实验结果显示,与对照组相比,WP1066或 shSTAT3抑制STAT3联合照射组明显增加U251细胞的凋亡;4、GFP-LC3凝集簇实验结果显示:WP1066联合照射或shSTAT3联合照射均较单纯照射组绿色荧光凝集簇增加;5、western b l o t结果显示药物或基因抑制S T A T3均可引起调亡相关蛋白cleaved caspase3、cleaved PARP1及自噬相关蛋白 Beclin1、ATG5、LC3II/LC3I表达的上调。(三)进一步研究下调STAT3联合电离辐射介导的细胞自噬性质,分别予药物3-M A及 siATG5抑制自噬。1、克隆形成实验结果:与对照组或单纯抑制STAT3组相比,3-M A或siATG5联合抑制STAT3可明显增加U251细胞的放射敏感性,同时,siATG5联合shSTAT3可明显增加A172细胞的放射敏感性;2、Annexin V-PE流式细胞检测U251细胞凋亡结果提示,与各自对照组或抑制STAT3联合照射组相比,抑制自噬、STAT3联合照射组U251细胞凋亡率明显升高;3、GFP-LC3凝集簇实验显示,WP1066、抑制自噬联合电离辐射组可明显减少U251细胞内绿色凝集素的形成;4、Western b l o t实验结果显示,抑制S T A D及自噬联合照射,可明显增加U251内凋亡及自噬相关蛋白表达的上调。 结论:4、8Gy X射线可明显增加U251细胞凋亡、自噬以及细胞内STAT3蛋白水平磷酸;W P1066或 shSTAT3抑制STAT3联合X射线可明显降低细胞内P-STAT3表达水平,同时增加U251细胞凋亡与保护性自噬;予3-M A或siATG5抑制自噬,可明显降低U251细胞保护性自噬,介导更多细胞走向凋亡途径,从而增加U251、A172细胞的放射敏感性。