人类胚胎多能性干细胞主要来源于附植前胚胎内细胞团(ICM)细胞和附植后早期胚胎的原始生殖细胞(PGCs)，是这两种细胞在体外经长期抑制分化培养而获得的，分别称为人类胚胎干(ES)细胞和人类胚胎生殖(EG)细胞。这两种细胞都具有体外无限增殖和分化为体内任意三个胚层细胞类型的潜能。 本文主要对人类EG细胞分离及体外培养的体系进行优化。虽然自1998年Shamblott等首次报道获得人类EG细胞系以来，已经有4个实验室报道了人类EG细胞的建系成功，但是这些培养体系都存在诸如建系效率低，自发分化严重和动物源性物质污染等一些问题，有待进一步优化。 为了增加这个体系的稳定性，建系效率以及未来人类的临床应用的安全性，本实验建立了人源的饲养层体系，对影响人类EG细胞建系的几个最主要因素如分离培养方法、细胞因子、饲养层、血清、胎龄等进行了实验分析，并对人类EG细胞在无异源污染的培养体系中的增殖进行了实验分析。 1.人源饲养层体系的建立 建立了人类皮肤成纤维细胞(hSF)的分离、体外培养、冻存复苏及饲养层制作体系。分别从3个5-8月龄胎儿皮肤建立了3个hSF细胞株。冻存复苏及体外传15代后细胞活力和细胞形态均无明显变化。 2.分离培养方法、细胞因子、血清、饲养层及胎龄对人类EG细胞体外增殖的影响 使用不同的原代细胞分散方法，结果显示消化后轻微吹打能够在原代获得更高的集落形成率。 使用含LIF和/或bFGF的培养基培养人类EG细胞，结果显示LIF对人类EG细胞体外增殖必需，LIF和bFGF协同发挥作用。 使用hSF、mEF和FBS、KSR的不同组合培养人类EG细胞，结果显示无血清培养基在原代有更高的集落形成率，体外传代时间也更长；hSF和mEF都能支持人类EG细胞的体外增殖，差异不显著。 比较胎龄对人类EG细胞原代集落分离效率的作用，说明7～9周是人类EG细胞最佳的分离时机。 3.无异源体系对人类EG细胞体外增殖的作用 对比人类EG细胞在KSR+hSF，KSR+mEF，FBS+mEF，FBS+hSF体系的增殖，结果显示在原代AKP阳性集落数和传代时间上，KSR+hSF与KSR+mEF差异不显著；FBS+hSF与FBS+mEF差异不显著；KSR+hSF(无异源体系)与KSR+mEF(无血清体系)明显优于FBS+mEF(传统体系)，差异显著。 本实验共分离人类EG细胞38例，在KSR+mEF体系和KSR+hSF最高传至第6代，在FBS+mEF体系最高传至第5代。