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目的:急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是以造血祖细胞未分化和不受控制的增殖为特征的异质性血液疾病。超过半数的AML患者表现为染色体核型正常(normal karyotype AML,NK-AML)。大约50%-60%的NK-AML患者发生核仁磷酸蛋白1(nucleophosmin1,NPM1)基因突变,其特征是NPM 1蛋白细胞质移位。NPM1基因突变是AML最常见的基因突变之一,NPM1突变白血病在2016年WHO白血病分型指南中被正式纳入为AML的一个独特亚型。然而,引起NPM1突变白血病细胞恶性表型的分子机制还有待于进一步探究。丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)是糖代谢过程中的关键限速酶。最近证实PK除了在糖酵解过程中发挥经典代谢酶作用之外,PK的M2型(pyruvate kinase isoenzyme M2,PKM2)还能发挥非代谢酶作用调控肿瘤的发生发展。然而,PKM2在白血病细胞中是否具有促癌的生物学作用尚不清楚。近年来自噬在白血病中的作用逐渐得到关注,且有报道称糖代谢相关酶可能参与调控肿瘤细胞的自噬过程。因此,本实验主要研究PKM2介导的NPM1突变白血病细胞自噬活性的改变及其潜在的机制,同时深入观察PKM2介导的自噬对白血病细胞存活和临床预后的影响。方法:第一部分采用Oncomine和TCGA数据库分析AML患者白血病细胞PKM2的表达。采用qRT-PCR和Western blot观察白血病细胞系和临床样本中PKM2的表达情况,进一步通过干扰或过表达多聚嘧啶区结合蛋白1(polypyrimidine tract binding protein,PTBP1)来观察PKM2上游剪切蛋白对PKM2表达的调控。第二部分在天然携带NPM1突变的OCI-AML3细胞系中干扰PKM2的表达,通过qRT-PCR和Western blot观察自噬标志物(LC3、p62)的变化,接着使用自噬诱导剂rapamycin处理细胞以观察自噬标志物的变化;另一方面,在THP-1和NB4细胞系中过表达PKM2观察自噬标志物的变化,在此基础上采用自噬抑制剂3-MA处理细胞以观察自噬标志物的变化。同时,观察干扰或过表达PKM2后自噬关键蛋白Beclin-1磷酸化水平的改变情况,过表达PKM2酶失活突变体K367M以进一步验证PKM2的酶活性调控作用。第三部分采用集落形成实验和流式细胞术检测干扰PKM2对OCI-AML3细胞体外增殖和凋亡的影响,进一步通过CCK-8试验结合rapamycin或Beclin-1活性肽(Tat-Beclin-1)处理来观察细胞的体外增殖情况;此外,在THP-1和NB4细胞系中过表达PKM2结合3-MA处理来检测细胞的增殖情况。最后,采用Kaplan-Meier生存分析PKM2表达对NPM1突变白血病患者预后的作用。结果:在NPM1突变阳性的OCI-AML3细胞系、临床AML患者细胞以及数据库中观察到PKM2基因和蛋白高表达,PTBP1能促进PKM2的表达。干扰PKM2能够降低OCI-AML3细胞中自噬标志物LC3的表达,升高p62的表达,而自噬诱导剂rapamycin则能够逆转干扰PKM2介导的自噬抑制;而在THP-1和NB4细胞中过表达PKM2则能够促进LC3、降低p62的表达,自噬抑制剂3-MA能够逆转过表达PKM2引起的自噬激活。机制上,干扰PKM2的表达可上调自噬关键蛋白Beclin-1的磷酸化水平,过表达PKM2则抑制Beclin-1的磷酸化水平,同时PKM2酶失活突变体K367M不能增加Beclin-1的磷酸化水平。值得注意的是,干扰PKM2能够抑制OCI-AML3细胞的克隆形成能力并使细胞凋亡率增加。干扰PKM2抑制细胞增殖而rapamycin或Tat-Beclin-1则可逆转这种抑制效应;过表达PKM2能够促进细胞增殖,而3-MA可抑制这种促增殖效应。最后,Kaplan-Meier生存分析结果表明,高表达PKM2的NPM1突变白血病患者总体生存率和无病生存率均显著下降。结论:在NPM1突变白血病细胞中PKM2有较高的表达,PTBP1可能参与其高表达的调控。PKM2能够通过磷酸化Beclin-1增强白血病细胞的自噬活性,促进细胞体外增殖。PKM2高表达与NPM1突变白血病患者的预后不良有关。本研究首次探讨了糖酵解酶PKM2在NPM1突变白血病细胞自噬及其存活中的重要作用,有助于阐明该型别白血病的发病机制以及为临床诊治提供潜在的靶点。