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目的:观察在神经干细胞缺氧损伤过程中,JNK是否被激活以及是否参与介导了缺氧所引起的神经干细胞的凋亡。研究TGF-β<,1>(transforming growth factor-β<,1>,TGF-β<,1>)对缺氧所引起的神经干细胞凋亡的保护机制是否与降低JNK的磷酸化水平有关。
方法:
1.从新生一天大鼠大脑皮质分离培养、增殖传代、诱导分化与鉴定神经干细胞(neural stem cells,NSCs),所用培养液为无血清DMEM/F12和B27,内含h-bFGF(20ng/ml)和h-EGF(20ng/ml),以胎牛血清诱导分化,用Nestin、β-ⅢTubulin和GFAP免疫细胞化学反应鉴定细胞性质和类型。
2.取传代细胞,随机分为6组:①正常组:普通培养7小时;②SP600125组:加XJNK抑制剂SP600125后普通培养7小时;③TGF-β<,1>组:加入TGF-β<,1>后普通培养7小时;④缺氧组:普通培养1小时后缺氧培养6小时,条件为N<,2>94%、CO<,2> 5%、O<,2> 1%;⑤SP600125+缺氧组:加入JNK抑制剂SP600125后普通培养1小时,再缺氧培养6小时;⑥TGF-β<,1>+缺氧组:加入TGF-β<,1>后普通培养1小时,再缺氧培养6小时。各组在相应时间点均用Hoechst33258进行荧光染色,镜下观察、计算Hoechst阳性细胞率,以比较SP600125和TGF-β<,1>对神经干细胞缺氧损伤的影响。
3.取传代细胞,随机分为3组:①正常组:普通培养5小时;②缺氧组:普通培养1小时后缺氧培养4小时,条件为N<,2> 94%、CO<,2> 5%、O<,2> 1%;③TGF-β<,1>+缺氧组:加入TGF-β<,1>后普通培养1小时,再缺氧培养4小时。各组在相应时间点用Western blot方法检测JNK磷酸化水平,以观察神经干细胞缺氧损伤过程中JNK的激活情况及TGF-β<,1>的保护作用。
结果采用SPSS13.0统计软件分析,数据以均数±标准差表示(mean±SD),Western blot数据采用单因素方差分析,多个实验组与一个对照组比较采用最小显著差法(LSD),实验组之间比较采用q检验。凋亡率数据先用arcsin<根号P>转换后进行方差齐性检验,然后行单因素方差分析。以P<0.05表示在统计学上有显著性差异,P<0.01表示在统计学上有极显著差异。
结果:
1.培养的细胞在未诱导分化前Nestin免疫反应阳性,诱导分化后可分别呈B-IIITubulin、GFAP免疫反应阳性,表明分离到的是神经干细胞。
2.正常组、TGF-β<,1>组和SP600125组偶见Hoechst染色阳性细胞。缺氧组Hoechst染色阳性细胞,即凋亡细胞显著增多(P<0.01)。TGF-β<,1>+缺氧组、SP600125+缺氧组的Hoechst阳性细胞比缺氧组明显减少(P<0.01),但仍比正常对照组、TGF-β<,1>组和SP600125组多(P<0.01)。
3.缺氧组磷酸化JNK的表达比正常组显著增高(Fig5),其免疫印迹反应条带光密度值是正常组的2.27倍(P<0.01)。TGF-β<,1>+缺氧组的磷酸化JNK的表达比缺氧组显著下降,仅为其0.60倍(P<0.01),但仍比正常组高,是正常组的1.37倍(P<0.01)。
结论:
1.缺氧诱导神经干细胞损伤过程中,JNK磷酸化水平显著增加,使用JNK抑制剂后神经干细胞的凋亡率显著下降,提示JNK可能参与介导了缺氧所引起的神经干细胞凋亡。
2.TGF-β<,1>可以降低神经干细胞缺氧损伤中的JNK磷酸化水平,并减少神经干细胞的凋亡率,提示TGF-β<,1>可能通过降低JNK的磷酸化水平而发挥其对神经干细胞缺氧损伤的保护作用。