论文部分内容阅读
结核病(tuberculosis,TB)是目前传染病的头号杀手。我国在全球22个TB高负担国家中居2位。目前常用的结核病诊断方法,主要依靠痰涂片、细菌培养、结核菌素(PPD)等检测技术,耗时长,敏感度和特异性低,常常导致漏诊和误诊,从而延误了和治疗时机,也给病人带来巨大的经济负担。因此,建立快速,敏感,简便的早期诊断方法是目前国内外检测结核病继续解决的问题。因此寻找到结核分支杆菌的特异性抗原,对于结核病的诊断具有重要意义免疫诊断作为其防控的早期诊断技术之一,近年来得到更加广泛的关注。而结核分枝杆菌RD区编码蛋白的发现,促进了结核病免疫诊断的迅速发展。酶联免疫吸附实验(ELISA)简单、快速、易于操作、又不需特殊精密仪器,由于该检测方法具有被广泛应用于临床检验以及科学研究中。将酶的高效催化作用和抗原或抗体的免疫方法结合起来,对抗原抗体反应级联放大,再经酶分解底物显色,敏感地检测血清中微量的特异性抗原或抗体。将优势抗原和酶联免疫吸附实验结合起来,建立起快速、简便、准确的血清学免疫诊断法受到越来越多的关注本文选取RD区编码的基因esat-6和Rv1984,利用PCR从结核分枝杆菌标准株H37Rv株扩增出目的片段,并将其分别克隆到表达载体pET30a和pET28a中,构建重组表达质粒并转化到E.coil BL21(DE3)表达菌株,经IPTG诱导表达后,用SDS-PAGE进行分析,选最佳的表达条件和可溶性分析。用纯化后的Rv1984c、ESAT-6和ESAT-6-CFP-10-16KD重组蛋白做为包被抗原,对结核病人进行血清免疫学检测。探讨单个抗原和混合抗原对结核病诊断的敏感性和特异性,为进一步结核病诊断试剂盒的研发提供依据。结果：1.用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv国际标准株中扩增出目的基因Rv1984c和esat-6基因大小与目的基因大小一样,分别为576bp和288bp；构建的重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定,经NCBI比对后,符合率都达到100%；2.重组工程菌pET28a-Rv1984c和pET30a-ESAT-6,分子量分别为23KD和17.1KD。pET28a-Rv1984c在25℃,终浓度为1mM IPTG诱导6h时表达量最多；pET30a-ESAT-6在25℃,终浓度为1mM IPTG诱导4h时表达量最多,之后随着诱导时间的增加,表达量逐渐下降。3.重组工程菌pET28a-Rv1984c超声破碎后,经SDS-PAGE分析为包涵体表达,经半透膜透析复性后为可溶性表达；重组工程菌pET30a-esat-6超声破碎后,经SDS-PAGE分析为可溶性表达；4.pET28a-Rv1984c和pET30a-esat-6经Ni-NTA亲和纯化后分别获得纯度为97.4%和51.2%的重组蛋白。5.重组蛋白pET28a-Rv1984c和pET30a-ESAT-6、ESAT-6-CFP-10-16KD为包被抗原建立间接ELISA法,结核病患者、非结核呼吸系统疾病患者和健康人群血清。结果显示,灵敏度分别为46.8%,70.21%和88.37%,特异性分别为76.71%,90.4%和97.4%,交叉反应率10%,40%和15%。