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绒癌(choriocarcinoma,CCA)是一种继发于正常或异常妊娠之后的滋养细胞肿瘤,恶性程度极高,发生转移早而广泛。F10基因(GenBank号:AB196290)是本研究团队从葡萄胎与正常早孕绒毛的差异cDNA文库中筛选出的与绒癌发生及侵袭行为相关的新基因[1]。F10基因对绒癌细胞增殖、细胞周期的影响尚未完全清楚。前期研究通过构建RNAi慢病毒载体及真核质粒表达载体,将设计构建的重组体转染到绒癌细胞,经筛选及包装后获得F10基因稳定沉默及过表达的绒癌细胞系JAR[2],采用CCK-8法、流式细胞仪、Western-Blotting、免疫荧光细胞化学技术等方法,探讨F10基因功能与部分细胞周期蛋白表达的关系,对新基因F10参与绒癌细胞系JAR增殖和细胞周期调节的机制进行初步研究。一、研究内容和研究方法我们选择已建立并筛选的F10基因沉默、稳定过表达绒癌细胞系JAR,以未处理组绒癌细胞为对照组,采用CCK8法绘制细胞生长曲线观察F10沉默及过表达对绒癌细胞生长的影响,同时使用流式细胞仪检测F10基因对细胞周期的影响,进一步通过Western-Blot检测绒癌细胞相关周期蛋白比如:cyclinA2、cyclinB1、cyclin C、cyclinD1、cyclinE、CDK1、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK8、CDK9、P16、P21以及相关细胞周期调节因子:增殖细胞核抗原(PCNA)、黏着斑激酶(FAK)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4(PAK4)的表达水平差异,并用免疫荧光细胞化学技术定位及定量上述周期的蛋白的表达差异。二、结果1.生长曲线反映三组JAR细胞在第一天即开始出现增殖,均呈指数生长,F10过表达组增殖速度最快,未处理组次之,F10沉默组最慢,因此,F10基因的沉默减缓细胞的生长速度,对绒癌细胞的增殖有抑制作用,而F10基因的过表达对绒癌细胞的生长有促进作用。2.流式细胞仪检测结果显示,三组JAR细胞中,F10沉默组出现了明显凋亡峰,F10过表达组细胞的G2/M期细胞比例(41.37%)较F10沉默组(17.06%)升高2.4倍,未处理组(20.77%)较F10沉默组升高1.2倍,二组相比差异有显著性差异(p<0.05),说明F10沉默组、未处理组、F10过表达组的G2/M期细胞依次增多,说明3组细胞增殖周期依次加快。提示F10基因的沉默可能增加绒癌细胞的凋亡,而F10基因过表达有促进细胞增殖的作用。3.三组绒癌细胞系JAR的周期蛋白表达水平差异。3.1细胞周期正性调节因子:Western blot检测结果示:与未处理对照组相比,F10 基因沉默组 cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK3、CDK5、CDK6,CDK8、CDK9蛋白表达水平显著低于未处理对照组(p<0.001),F10过表达组cyclinA2、B1、C、D1、E和CDK6、7、8、9蛋白表达水平显著增高(p<0.001);免疫荧光细胞技术检测结果示:与未处理对照组比较,F10基因沉默组cyclinB1、D1、E 和 CDK1、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK8、CDK9 蛋白表达水平显著低于未处理对照组(p<0.05),F10基因过表达组cyclinB1、D1、E和CDK1、CDK2、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK8、CDK9 蛋白表达水平显著高于未处理对照组(p<0.05)。3.2细胞周期负性调节因子:Western blot检测结果示:F10基因沉默组、未处理组及过表达组三组细胞P16蛋白表达阳性,且呈上升趋势,沉默组较未处理组、过表达组较未处理组均有统计学差异(p<0.05),免疫荧光细胞技术检测P16蛋白表达结果于Western blot检测结果一致。然而,结合Western blot检测结果与免疫荧光细胞技术检测结果示三组细胞P21的蛋白表达差异并不显著。3.3丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4(PAK4):Western blot检测结果示F10基因沉默组PAK4蛋白表达水平显著低于未处理对照组(p<0.05),F10基因过表达组PAK4蛋白表达水平显著高于未处理对照组(p<0.05),与免疫荧光细胞技术检测结果一致。3.4增殖细胞核抗原(PCNA):Western blot检测结果示三组细胞的增殖细胞核抗原PCNA蛋白水平表达无差异,而免疫荧光细胞技术检测结果示:F10基因沉默组PCNA达水平显著低于未处理对照组(p<0.05),F10基因过表达组PCNA蛋白表达水平显著高于未处理对照组(p<0.05)。3.5黏着斑激酶(FAK):Western blot检测结果示F10基因沉默组及过表达组FAK蛋白表达水平均显著高于未处理对照组(p<0.05),以F10沉默组与未处理组的差异为明显,免疫荧光细胞技术检测FAK蛋白表达结果示F10基因沉默组FAK蛋白表达水平均显著高于未处理对照组(p<0.05);而F10过表达组与对照组间无明显差异。3.6绒癌细胞中细胞周期蛋白调节因子的定位:在绒癌细胞中,CyclinA2、D1和CDK7蛋白表达完全在肿瘤细胞核中;cyclinE、CDK1、CDK2、CDK6、CDK8、CDK9、P21蛋白主要表达在细胞核,少量在胞浆中;cyclinB1、C和CDK3、CDK4、CDK5、P16、PAK4、FAK蛋白主要定位于细胞质中,PCNA在细胞核和细胞质中均有表达。三、结论1.通过CCK8法绘制生长曲线,发现F10基因沉默后,绒癌细胞系JAR出现了生长速度减缓,而F10基因过表达使绒癌细胞生长速度加快,提示F10基因促进绒癌细胞生长,从而推测F10基因可能参与其增殖过程。2.流式细胞仪检测细胞周期实验显示F10沉默组、F10未处理组、F10过表达组的G2/M期细胞依次增多,3组细胞周期依次加快,提示F10基因可能通过影响细胞周期,从而干预绒癌细胞增殖。3.Western blot及免疫荧光细胞技术证实了 F10基因通过调节部分细胞周期蛋白表达,加快细胞周期进程,促进绒癌细胞增殖。