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研究背景角膜病是我国的主要致盲病之一,在临床上,角膜盲仍然将角膜移植作为最可靠、最有效的复明手段。尽管因为角膜免疫赦免机制的存在使之成为存活率最高的实质器官移植手术,但是移植术后的免疫排斥反应仍然是导致角膜移植失败的首要原因。目前临床治疗中最常采用如糖皮质激素、环孢素A等非特异性免疫抑制剂,疗效虽然明显但全身副作用大,容易导致恶性肿瘤、感染、肝、肾、心血管等系统并发症。更重要的是,虽然目前临床上常用的免疫抑制剂能够在一定程度上有效地预防和治疗急性排斥反应,但对于慢性排斥反应则疗效甚微,进而导致后期移植物失功,而且每年仍有不少患者因为慢性排斥反应而需要接受再次移植治疗。探讨及研究在角膜移植排斥反应中起关键作用的细胞或因子,然后再予以针对性治疗是较理想的治疗方案,可以避免免疫抑制剂所带来的副作用。FGL-2即纤维介素蛋白,属于纤维蛋白原样相关蛋白超家族,与纤维蛋白原在p及丫链具有同源性,具有跨膜型及分泌型两种形式。跨模型主要表达在血管内皮细胞及巨噬细胞表面,是一种凝血酶原酶,可将凝血酶原切割成凝血酶,从而促进凝血；分泌型主要由T细胞分泌,具有免疫调节作用。FGL-2与一系列纤维沉积性疾病有关,如病毒感染爆发性肝炎,Thl细胞因子诱导的流产综合征。同时,FGL-2在促进肿瘤生长、促使新生血管形成中发挥重要作用。有研究表明,阻断FGL-2后,出现FGF表达下降及ERK1/2磷酸化水平降低,而FGF广泛表达于角膜上皮及内皮细胞,能直接促进血管内皮生长,FGF与ERK1/2降低直接影响到下游VEGF表达,进而导致新生血管、淋巴管生成减少。白细胞介素23(IL-23)是Oppmann等于2000年发现的,属于IL-12细胞因子家族的一个新成员,是由p19和p40亚单位通过二硫键形成的异源二聚体分子,结构为p19/p40,任何一个亚单位单独存在都不具备生物学功能,只有两个亚单位结合在一起才能发挥它的生物学活性。IL-23主要由活化的树突状细胞、巨噬细胞及小胶质细胞等抗原提呈细胞分泌。IL-23受体(IL-23R)同样是异源二聚体,主要表达于固有免疫细胞及适应性免疫细胞如γξT细胞、NK T细胞及Th17细胞等,在单核细胞、树突状细胞及巨噬细胞低水平表达,同时IL-23受体也表达于受体骨髓来源的浆细胞。IL-23与IL-12有共同的亚单位p40,故最开始认为IL-23与IL-12具有相同生学功能,然而近期越来越多的实验表明,IL-23在免疫调节反应中具有其独特功能。IL-23在自身免疫性疾病如实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)、炎性肠炎(inflammatory bowel disease, IBD)和风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)及感染中发挥着重要作用。在肿瘤微环境中可以发现,IL-23含量显著高于正常组织,其可上调基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)9的表达,从而促进肿瘤血管的生成,抑制CD8+T细胞的浸润,在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。IL-23主要通过促使活化的记忆性T细胞分泌IL-17A从而发挥促炎作用,它能够促进维持Th17细胞分泌IL-17的特性,且不影响其扩增和存活。有报道IL-23/IL-17轴在自身免疫性疾病中起到重要作用,同时在器官移植术后排斥反应的发生过程中也起到促使排斥反应发生的作用。本课题通过建立大鼠间的穿透性角膜移植模型,以纤维介素蛋白2(FGL-2)及IL-23/IL-17轴作为研究对象,观察角膜移植术后不同时间点植片中纤维介素蛋白2(FGL-2)及IL-23/IL-17的表达变化,初步探讨二者在角膜移植术后免疫反应中的潜在生物学效应及其作用机制,为将来更有效地临床预防和治疗角膜移植免疫排斥反应提供新的策略。第一部分纤维介素蛋白2(FGL-2)在大鼠角膜移植排斥反应中的作用目的研究纤维介素蛋白2(fibrinogen- like protein 2,FGL-2)在大鼠角膜移植排斥反应发生发展过程中的作用及糖皮质激素对其表达的影响。方法1实验动物分组及处理 采用完全随机分组设计方案,应用随机数字表法将60只Wistar大鼠分为正常对照组12只、自体角膜移植组16只和同种异体角膜移植组16只、糖皮质激素组16只。糖皮质激素组穿透性角膜移植术后每日结膜囊点用典必舒眼液2次,直至取材。2角膜植片排斥反应发生的判断标准及显微镜下的观察 术后2周内每天裂隙灯显微镜下观察角膜植片情况,第3周开始每周观察3次,连续观察4周。参照Larkin等的评分标准对角膜排斥反应进行评分：(1)根据角膜混浊程度：0分,角膜植片无混浊,完全透明；1分,植片轻度混浊,透明度轻度丢失；2分,植片中度混浊,透明度中度丢失,虹膜血管可见；3分,虹膜血管窥不清,瞳孔轮廓可见；4分,瞳孔轮廓窥不清。(2)水肿：0分,角膜植片厚度正常,无水肿；1分,角膜植片稍增厚,同时伴有中度水肿；2分,伴有植片增厚的显著水肿。(3)新生血管：0分,植片无任何新生血管；1分,新生血管长入植片内且超过任何象限的半径的1/4；2分,新生血管长入植片内且超过任何象限的半径的1/2；3分,新生血管长入植片内且超过任何象限的半径的3/4；4分,新生血管达到植片中央。角膜植片混浊程度、水肿及新生血管评分之和为当日排斥反应指数(rejection index,RI),RI≥5分或植片混浊程度评分≥3分即认为免疫排斥反应发生。植片透明达100 d者确定为长期存活。3角膜组织病理学观察及免疫组织化学法检测FGL-2在角膜组织中的表达术后9 d、14 d每组取大鼠眼球行多聚甲醛固定,4%乙醇脱水,石蜡包埋,切片成4μm,部分植片采用苏木素-伊红染色法观察植片的炎症反应情况；部分行免疫组织化学检测,检测角膜组织中FGL-2的表达量。4实时荧光定量PCR检测植片中FGL-2 mRNA的相对表达术后9d、14 d各组均取5只大鼠的角膜植片液氮碾磨、匀浆后置于含1 mL Trizol的离心管中,采用Trizol一步法提取总RNA,并进行逆转录及PCR扩增反应,检测角膜植片中FGL-2的nRNA的表达量。结果术后各组角膜植片均出现了不同程度的混浊、水肿及新生血管形成,且随时间不同,其程度也不一致。同种异体角膜移植组大鼠平均在穿透角膜移植术后9.8 d发生排斥反应并获病理学支持；自体角膜移植组和糖皮质激素组大鼠术后排斥反应计分未达到诊断标准。免疫组化结果显示,不同时间点同种异体组阳性反应细胞明显多于自体角膜移植组和糖皮质激素组。PCR检查结果提示：术后自体角膜移植组、同种异体角膜移植组及糖皮质激素组手术干预组角膜FGL-2 mRNA的表达均增加,在9d和14d时同种异体角膜移植组均较自体角膜移植组和糖皮质激素组高,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。结论FGL-2可能参与角膜移植免疫排斥,糖皮质激素可能通过降低其表达发挥抗排斥作用。第二部分IL-23/IL-17在大鼠角膜移植排斥反应中的作用目的研究IL-23/IL-17轴在大鼠角膜移植排斥反应发生和发展过程中的作用及糖皮质激素对其表达的影响。方法1实验动物分组及处理 采用完全随机分组设计方案,应用随机数字表法将60只Wistar大鼠分为正常对照组12只、自体角膜移植组16只和同种异体角膜移植组16只、糖皮质激素组16只。糖皮质激素组穿透性角膜移植术后每日结膜囊点用典必舒眼液2次,直至取材。2植片排斥反应发生的判断标准及显微镜下的观察 术后2周内每天裂隙灯显微镜下观察角膜植片情况,第3周开始每周观察3次,连续观察4周。参照Larkin等的评分标准对角膜排斥反应进行评分。角膜植片混浊程度、水肿及新生血管评分之和为当日排斥反应指数(rejection index,RI),RI≥5分或植片混浊程度评分≥3分即认为免疫排斥反应发生。植片透明达100 d者确定为长期存活。3角膜组织病理学观察及免疫组织化学法检测FGL-2在角膜组织中的表达术后9 d、14d每组取大鼠眼球行多聚甲醛固定,常规梯度乙醇脱水,石蜡包埋,切片,部分植片采用苏木素-伊红染色法观察植片的炎症反应情况；部分行免疫组织化学检测,检测角膜组织中IL-23/IL-17的表达量。4实时荧光定量PCR检测植片中IL-23/IL-17mRNA的相对表达术后9d、14d各组均取5只大鼠的角膜植片液氮碾磨、匀浆后置于含1 mL Trizol的离心管中,采用Trizol一步法提取总RNA,并进行逆转录及PCR扩增反应,检测角膜组织中IL-23/IL-17的mRNA的表达量。结果术后各组角膜植片均出现了不同程度的混浊、水肿及新生血管形成,且随时间不同,其程度也不一致同种异体组大鼠平均在穿透角膜移植术后9.8 d发生排斥反应并获病理学支持；自体组和糖皮质激素组大鼠术后排斥反应计分未达到诊断标准。术后9天及14天3组手术干预组角膜IL、IL-17 mRNA的相对表达均增加,同种异体组较自体组及糖皮质激素组表达增高,且与糖皮质激素组比较差异具有统计学意义。结论IL-23/IL-17轴可能参与角膜移植免疫排斥反应,糖皮质激素可能通过降低其表达发挥抗排斥作用。