研究背景：程序性细胞死亡(Programmed cell death, PCD)在生物生长发育过程和疾病的发展过程中起着重要的作用。基于形态学和生化改变的特征将PCD分为三种类型：凋亡、自噬和程序性坏死。细胞凋亡是第一个发现的PCD,根据涉及的信号调控分子又可分为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)依赖和caspase非依赖途径。大多数的caspase非依赖性细胞死亡途径作用于线粒体,细胞凋亡诱导因子(Apoptosis inducing factor, AIF)被认为是主要的效应分子。AIF从线粒体释放入细胞质,然后进入细胞核引起染色质浓缩和溶解。程序性坏死是一种caspase非依赖性PCD,显示出坏死的形态特征,如核固缩、细胞器肿胀,但是可以由许多分子控制。受体相互作用蛋白1 (Receptor-interacting protein, RIP 1)和受体相互作用蛋白3(RIP3)形成的复合物(necrosomes)是程序性坏死的关键启动因子。有研究指出DNA烷化剂诱导的程序性坏死中,AIF也起到重要作用。由此AIF可能是影响caspase非依赖性凋亡和程序性坏死的共同因素。我们课题组前期研究发现全脑缺血／复灌损伤诱导的大鼠海马CA1区神经元死亡特点符合程序性坏死而非传统的凋亡模式。RIP3是程序性坏死的关键调节因子,并且在大鼠全脑缺血／复灌损伤后,位移进入细胞核发挥引起细胞死亡的作用和。但是RIP3入核后引起神经元程序性坏死的机制,以及RIP3与AIF的关系尚不明确。此外我们还通过电镜观察到大鼠海马神经元程序性坏死进展过程中存在细胞器破裂、细胞膜与核膜消失、核固缩。溶酶体膜的完整性受到损坏,使溶酶体水解酶释放到细胞质中。早期的研究认为溶酶体酶的释放通常导致细胞非程序性坏死；然而近期的许多研究也提示,溶酶体酶的释放在程序性细胞死亡中也起着关键作用,这取决于溶酶体膜损伤的程度和释放的水解酶的量。溶酶体膜通透性(Lysosomal membrane permeability, LMP)改变,但是超微结构没有发生明显的变化,溶酶体酶向细胞质释放是有限的。根据课题组之前电镜观察的结果,我们认为程序性坏死的发生发展过程与溶酶体酶的释放存在关联,但缺乏进一步的研究。组织蛋白酶B (Cathepsin-B)是具有代表性的溶酶体水解酶,在生理和病理过程中具有重要的作用。严重的氧化应激可以诱导损伤溶酶体膜结构和Cathepsin-B的泄漏。CA074-me是Cathepsin-B的抑制剂,可以与Cathepsin-B形成复合物抑制Cathepsin-B的活性。CA074-me经侧脑室给药可以保护大鼠大脑中动脉闭塞损伤(Middle cerebral artery occlusion, MCAO),但是其在全脑缺血引起的程序性坏死中的作用,以及与溶酶体通透性的关系没有得到明确证实。研究目的：基于以上的研究背景,我们建立程序性坏死主导的大鼠全脑缺血／复灌损伤模型,试图解决以下问题：(1) 探索大鼠全脑缺血／复灌损伤后,可能与RIP3相互作用的分子,进一步揭示其在程序性坏死中的作用机制；(2)探索不同死亡信号通路的抑制剂预处理对海马神经元程序性坏死的作用；(3) 通过离体细胞及整体动物实验探讨溶酶体膜通透性对海马神经元程序性坏死的影响第一部分RIP3与AIF相互作用在大鼠海马神经元缺血性程序性坏死中的机制研究研究方法：取体重280-350g的成年雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠,制作大鼠全脑缺血／复灌损伤模型。采用四血管法,电凝双侧椎动脉,夹闭双侧颈总动脉缺血20分钟后恢复血流再灌注。分别在缺血前1小时侧脑室注射程序性坏死抑制剂Necrostatin-1 (Nec-1)、自噬抑制剂3-Methyladenine (3-MA)和caspase-3抑制剂Ac-DMQD-CHO,复灌后2天、3天、7天取脑、石蜡包埋,行HE染色计算海马CA1区神经元存活率。TUNEL染色,计数CA1区神经元阳性细胞率。免疫荧光双染,组合如下RIP3分别和β-Tubulin-Ⅲ(神经元胞浆特异性标记)、AIF双染；Neun(神经元细胞标记)分别和激活型caspase-3、caspase-8双染；caspase-8分别和11)a-1(小胶质细胞特异性标记物)、GFAP(星形胶质细胞特异性标记物)双染。观察相应的蛋白表达及空间分布。Western blot检测LC3-Ⅱ、MLKL、AIF的表达变化。以RIP3为沉淀蛋白做免疫沉淀,Western blot检测RIP3与AIF、RIP3与RIP1间的相互作用。实验结果：免疫荧光和免疫共沉淀研究发现缺血／复灌损伤后海马神经元RIP3与AIF相互结合并在细胞核内共定位。Western blot研究发现AIF和MLKL在缺血／复灌损伤后表达没有变化,但是LC3-II表达增多。HE检测显示Nec-1和3-MA对神经元缺血／复灌损伤有保护作用。TUNEL染色提示二者可以减少神经元DNA的断裂。免疫组化和免疫共沉淀进一步提示Nec-1和3-MA可以阻止RIP3进入细胞核及与AIF在细胞核内共定位。结论：RIP3与AIF在细胞核内共定位并且相互作用是缺血/复灌损伤诱导的神经元程序性坏死的关键,Nec-1和3-MA通过抑制二者的结合减轻全脑缺血/复灌引起的神经元损伤。第二部分CA074-me在全脑缺血/复灌损伤诱导海马神经元程序性坏死中的作用及机制研究研究方法：在大鼠全脑缺血前1小时和复灌开始后1小时分别侧脑室注射CA074-me,复灌后7天、30天处死大鼠,取脑石蜡包埋,行HE染色计算海马CA1区神经元存活率。提取海马组织进行免疫荧光检查和Western blot检查,观察缺血/复灌后大鼠海马区Cathepsin-B、溶酶体相关膜蛋白-1 (Lysosomal associated membrane protein-1, LAMP-1)、RIP3和蛋白热休克蛋白70 (Heat shock protein 70, HSP70)的表达变化及CA074-me的干预作用。NAD+/NADH试剂盒检测复灌1天海马组织NAD+变化情况。离体培养新生大鼠海马原代神经元,氧糖剥夺/复氧复糖损伤(Oxygen-glucose deprivation, OGD)后,通过DND-153染色评价水解酶释放对溶酶体pH值及功能的影响,评价CA074-me对神经元溶酶体膜完整性的保护作用。实验结果：无论是缺血前还是复灌后1小时侧脑室注射CA074-me对神经元均有保护作用。免疫荧光检测发现缺血/复灌损伤后海马神经元Cathepsin-B和LAMP-1表达增多、形态不规则。CA074-me预处理不仅能抑制二者的变化,还可以抑制RIP3表达增多及向细胞核内转移。CA074-me能明显抑制缺血损伤后海马组织NAD+水平的下降、提高HSP70的表达。CA074-me还可以抑制OGD后神经元溶酶体膜通透性增加导致的pH值的变化。结论：全脑缺血／复灌损伤诱导的神经元程序性坏死与溶酶体通透性改变关系密切。CA074-me除了直接抑制Cathepsin-B的活性,还可以通过抑制RIP3核转移、增强HSP70的表达和维持能量平衡对溶酶体膜稳定性产生影响,起到保护神经元的作用。