骨改建，一直是口腔医学研究的重点，因为牙槽骨是全身骨组织中代谢最活跃的部分，是能够终生改建的骨组织。众多口腔疾病或生理性骨改建都与牙槽骨的代谢、吸收、缺损、修复等过程息息相关。正畸牙齿移动的生物学基础是牙齿在适当的力的作用下，改变其在牙槽骨中的位置，这个过程中牙槽骨发生了以成骨和破骨为主要形式的骨改建。成骨和破骨这两个主要的骨代谢过程达到动态的平衡才能维持正常的骨代谢进程，这种动态平衡的维系需要成骨细胞、破骨细胞、相关细胞因子以及全身因素的共同参与。人们利用各种因素通过影响成骨细胞进而干预骨形成过程，所有这些研究最终均需要深入到信号通路的层面，进一步探究机制。由于刺激因素不同，经由的信号转导通路亦有不同，但是也有交叉，反映了成骨细胞调控骨形成的途径并不唯一，而且各通路间有交叉，有联系，错综复杂。目前对于成骨细胞信号通路的研究中比较深入也比较成熟的有ERK1/2，p38MAPK等，人们发现ERK1/2MAPK在调控细胞增殖与分化方面发挥重要作用，p38MAPK经常参与调控细胞分化及凋亡过程。另外，成骨相关重要的转录因子Runx2在成骨细胞调控骨改建方面扮演重要角色，众多信号通路的激活最终都将通过影响Runx2的活性来影响成骨细胞的功能。寡核苷酸(oligodeoxynucleotides, ODN)是指含有20-50个核苷酸单体的多核苷酸链，DNA或RNA降解产物中常有以ODN形式存在的核苷酸链。研究表明ODN通过受体介导的形式被细胞摄取，无需另行构建载体就可以进入细胞发挥作用，经磷酸硫代化修饰可提高其细胞摄取率并且增强抵抗体内核酸酶消化的能力。由于ODN还具有高效低毒、易于合成且性质稳定的优势，因此近年来成为免疫学领域及基础医学领域的研究热点。本课题组与分子生物学及免疫学相关研究人员共同研究了对成骨有影响的ODN，前期结果显示，特定序列的ODN MT01可以促进骨髓间充质干细胞成骨分化，促进成骨相关因子Runx2、Osterix和Ⅰ型胶原mRNA的表达；特定序列ODN还可以促进成骨细胞MG63增殖和分化，上调OPG同时抑制RANKL的表达水平，这为深入研究特定序列ODN促进骨改建过程提供了实验基础及理论基础。根据前期研究的结果及发现的问题，提出新的科学假设：ODN MT01是通过胞吞作用进入细胞内发挥调控作用；ODN MT01促进成骨细胞MG63的分化经由ERK1/2及p38MAPK通路，并且Runx2也参与ODN MT01的调控作用。根据此假设，我们设计实验如下：应用激光共聚焦显微镜及荧光标记法对ODN MT01进入细胞的时相性进行观察探讨；应用western blot技术、realtime PCR技术及碱性磷酸酶（ALP）染色技术等检测ODN MT01对MAPK通路重要蛋白的激活情况及激活时相性；进而应用ERK1/2MAPK及p38MAPK信号通路蛋白激酶抑制剂进行抑制，检测成骨细胞早期分化指标ALP的变化情况，对晚期分化指标OC和Colla I的变化进行基因和蛋白两方面检测。另外，检测ODN MT01对成骨调控关键因子Runx2磷酸化的影响，以及Runx2总蛋白的影响，进一步阐明ODN MT01促进成骨细胞分化的机制，为ODN调控骨改建的研究奠定理论基础。本研究具体内容将分为五部分实验展开：第一部分：ODN MT01进入成骨细胞的时相观察应用人源性成骨细胞系MG63为研究对象；应用Cy5标记ODN MT01（1mg/L）,按照检测时间与MG63细胞共同孵育，激光共聚焦显微镜观察ODN MT01进入细胞情况，统计细胞内红色荧光表达强度，观察ODN MT01进入细胞的时相性。第二部分：ODN MT01对ERK1/2及p38MAPK磷酸化的影响应用western blot方法，以ODN FC003（1mg/L）作为阴性对照，检测ODNMT01（1mg/L）对ERK1/2和p38蛋白的激活情况，以及激活时间；并且证明这种激活作用是序列特异性的。第三部分：ERK1/2抑制剂及p38MAPK抑制剂对ODN MT01作用下成骨细胞早期分化的影响应用ERK1/2MAPK特异性抑制剂U0126和p38MAPK抑制剂SB203580分别预先作用成骨细胞1h，更换培养基，加入ODN MT01(1mg/L)，继续培养至24h,48h,72h收获细胞，以PBS组为空白对照，检测细胞内ALP活性。第四部分：ERK1/2抑制剂及p38MAPK抑制剂对ODN MT01调控成骨细胞分化下游基因的影响应用ERK1/2MAPK特异性抑制剂U0126和p38MAPK抑制剂SB203580分别预先作用成骨细胞1h，更换培养基，加入ODN MT01(1mg/L)，继续培养至15d，收获细胞，应用realtime-PCR技术及western blot技术从mRNA水平及蛋白水平检测成骨分化晚期标志基因OC及Colla I的表达。第五部分：ERK1/2抑制剂及p38MAPK抑制剂对ODN MT01调控下Runx2的影响Runx2是成骨细胞分化调控的重要转录因子，位于ERK1/2及p38MAPK的下游参与调控成骨细胞分化。应用ODN MT01作用于成骨细胞，检测Runx2总蛋白变化及磷酸化情况。应用蛋白酶抑制剂预先作用成骨细胞后，检测Runx2总蛋白及磷酸化情况，进一步阐述ODN MT01调控成骨细胞的机制。实验得到以下结果：第一部分：随着加药时间的变化，ODN MT01进入细胞的量表现出一定的时间依从性规律。加入Cy5荧光标记的ODN15min之后镜下可见少量红色荧光，但不明显；30min后红色荧光开始清晰；至加药6h可见成骨细胞呈梭型，红色荧光聚集在细胞质中，非常清晰，细胞核中并不可见红色荧光，说明此时ODN MT01已经进入细胞质中，但是并没有入核；至加药12h后，ODN MT01进入细胞的量达到了峰值，可见细胞质内红色荧光较强，但细胞核内仍未见红色荧光；加药24h,36h,及48h后，红色荧光强度逐渐减弱。第二部分：应用Western blot技术检测ODN MT01（1mg/L）作用于成骨细胞后，ERK1/2蛋白激活情况：与0min比较，加药30min后的ERK1/2磷酸化水平增加，到了60min后，磷酸化水平达到高峰（P<0.05），24h和48h均较0min增加，有显著差异（P<0.05）。p38总蛋白的量并未受到影响,但是磷酸化p38的变化比较明显。与0min比较，30min时p-p38表达降低，但是无显著性差异，60min磷酸化增强，差异显著（P<0.01）,在24h磷酸化程度达高峰（P<0.05），48h均较0min增加，差异显著（P<0.05）。阴性对照组ODN FC003对ERK1/2及p38均无影响，总蛋白量及磷酸化水平均无明显变化。第三部分：应用ALP试剂盒测定成骨细胞内ALP表达的量。ODN MT01单独作用于成骨细胞时，48h和72h的ALP表达量较PBS组增强，差异有显著性（P<0.05）；抑制剂与ODN MT01共同孵育组这种增强的趋势被抑制，但是ALP的表达量比单独加抑制剂组要高（P<0.05）。第四部分：应用realtime-PCR技术检测OC和Colla I的mRNA相对表达量，与对照组相比，ODN MT01显著促进了成骨细胞中OC和Colla I的mRNA表达，差异有显著性（P<0.05）。分别加入ERK1/2抑制剂及p38抑制剂预先作用于成骨细胞，然后再加ODN MT01，发现抑制剂抑制了ODN MT01对成骨细胞OC和Colla I的促进作用，较对照组有显著性差异（P <0.05）。并且ERK1/2抑制剂U0126的抑制作用较p38MAPK抑制剂SB203580的抑制作用更明显。第五部分：Western blot结果显示ODN MT01促进ERK1/2及p38MAPK磷酸化的同时，也促进了Runx2的磷酸化（P <0.05），而Runx2总蛋白的量虽然有所增加，但是差异无显著性（P <0.05）。蛋白激酶抑制剂U0126及SB203580分别预先作用于成骨细胞后再用ODN MT01作用于成骨细胞，抑制了一部分ODN MT01对Runx2的磷酸化影响。以上实验结果证实：ODN MT01通过胞吞方式进入成骨细胞MG63，浓度一定时ODN MT01进入细胞的量呈时间依赖性，ODN MT01进入细胞的细胞质内发挥作用，而并没有进入细胞核，ODN MT01是通过成骨细胞的内化，继而启动一系列信号转导途径，将信息转导至细胞核内，对细胞产生影响；ODNFC003未激活ERK1/2及p38MAPK, ODN MT01（1mg/L）可以激活ERK1/2及p38MAPK信号通路，这种激活作用是序列特异性的，ODN MT01对ERK1/2的激活早于p38蛋白激酶；蛋白激酶抑制剂能够抑制ODN MT01对成骨细胞早期分化的促进作用，ERK1/2及p38MAPK通路参与了ODN MT01对成骨细胞中ALP的促进作用； ERK1/2及p38MAPK信号通路参与了ODN MT01促进成骨细胞表达OC及Colla I的过程；ODN MT01能够促进成骨细胞分化关键转录因子Runx2磷酸化，对Runx2总蛋白表达量无明显影响，ODN MT01调控成骨细胞分化的过程是主要经由ERK1/2MAPK途径，次要经由p38MAPK途径，并且Runx2磷酸化也参与此过程中。以上研究结果为ODN应用于免疫学以外的领域奠定了实验基础，进一步阐述了特定序列ODN MT01在成骨调控方面的机制，为未来ODN MT01调控骨改建的应用奠定了理论基础。