论文部分内容阅读
一、MEKK2参与T细胞受体信号中JNK激活和IL-2基因表达 JNK（c-Jun N-terminal kinases）是MAPK（mitogen-activated protein kinase）家族基因的成员，对细胞增殖、分化和凋亡十分重要。以前的研究发现T细胞JNK激活需要T细胞受体和辅助受体如CD28的共刺激。本研究探讨MEKK2是否是T细胞中特异的JNK上游活化激酶，是否涉及转导来自TCR／CD3的T细胞信号激活JNK MAPK级联和T细胞特异基因IL-2的表达。利用多组织poly（A）杂交模板，用1kb N-末端人MEKK2做探针行Northern杂交。Jurkat T-细胞用电击法转染，COS-1细胞用Lipo-fectamine转染检测不同的基因表达或作用。抗JNK抗体免疫沉淀法，GST-cJun为作用底物体外检测JNK激酶活性；抗HA抗体、GST-JNKK2为作用底物体外检测MEKK2激酶活性。荧光酶报告基因检测IL-2和AP—1基因的表达。抗HA抗体12CA5、抗MEKK2抗体11281129、抗磷酸化抗体Pty20和ECL试剂盒进行蛋白印迹检测。 Northern杂交分析显示MEKK2在外周血细胞中有高水平表达。用AP-1报告基因在Jurkat细胞和COS-1细胞检测AP-1的转录活性，结果显示在T细胞MAPK级联中MEKK2位于JNK的上游。全长MEKK2 DNA的表达能导致JNK1强烈激活，而对Erk2没有作用。MEKK2也是JNK的强烈激活物，能激活JNK依赖的AP-1和IL-2报告基因表达。当用抗CD28抗体刺激时MEKK2介导的JNK活性无变化，而随着抗CD3抗体刺激，MEKK2介导的JNK活性显著增加。说明MEKK2参与抗CD3抗体激活JNK的信号通路。抗CD3抗体刺激后用抗磷酸化酪氨酸抗体分析MEKK2，发现CD3刺激能够迅速诱导MEKK2酪氨酸磷酸化。抗CD3和抗CD28抗体共刺激诱导的JNK激活能被无功能的MEKK2突变体抑制，而TPA（12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate）和Ca2+激动剂A23187的JNK激活不能被抑制。 以上结果显示人MEKK2在TCR／CD3介导的JNK MAPK激活和IL-2基因表达中是一重要信号分子。