枯草芽孢杆菌芽孢是目前芽孢表面展示技术中最常用的载体,该技术通过将外源蛋白与芽孢衣壳蛋白融合在一起而达到芽孢表面展示的目的,可在芽孢表面展示外源蛋白、疫苗和生物催化剂等物质。芽孢虽然具有抗逆性强,能应对极端环境的特点,但是芽孢对外界环境也极其敏感,一旦探测到有适宜其萌发的条件就开始萌发,恢复成营养细胞,在恢复成营养细胞的过程中芽孢衣壳会被降解脱落,导致芽孢表面展示的物质脱离芽孢,失去活性。本文对B.subtilis 168发酵培养基和培养条件进行优化,以求获得高密度的芽孢。通过单因素筛选实验,确定了B.subtilis 168培养基的最佳碳源为麸皮,氮源为玉米浆,无机盐分别为NaCl、K₂HPO₄、MgSO₄。通过添加范围的单因素试验确定各因素的最适添加浓度范围后,采用正交试验优化麸皮、玉米浆、NaCl、K₂HPO₄、MgSO₄的最佳配比。因Mn²⁺有促进芽孢生成的作用,所以向正交试验确定出的培养基中添加不同浓度的MnSO₄,确定MnSO₄促进芽孢生成的最适浓度为2.4 mmol/mL。本文确定的B.subtilis 168最佳产芽孢培养基为:麸皮8 g/L,玉米浆20 g/L,NaCl 4 g/L,K₂HPO₄ 2 g/L,MgSO₄ 2.5 g/L,MnSO₄ 0.4 g/L。通过对培养条件进行优化得到B.subtilis 168的最佳培养条件为初始pH值7.0、装液量100/500 mL、温度37℃、摇床转速180 r/min。优化后的菌数达到3.9×10⁹CFU/mL,芽孢数达到3.6×10⁹ CFU/mL,产芽孢率为92%。通过分析芽孢萌发相关基因,选择对枯草芽孢杆菌芽孢萌发过程中的皮层溶解酶基因sleB和cwl J进行敲除。首先以枯草芽孢杆菌168（Bacillus subtilis 168）基因组为模板,通过PCR扩增分别得到同源臂基因sleB1和cwlJ1,再以以卡那霉素（km^r）和博来霉素（zeo^r）作为抗性标记基因,通过重叠延伸PCR技术构建sleB1-km^r和cwl J1-zeo^r重叠片段并进行酶切和浓缩,经过电转和阳性重组子筛选,成功获得枯草芽孢杆菌芽孢萌发缺陷型工程菌B.subtilis 168ΔsleBΔcwlJ。发酵研究表明:通过绘制菌体典型生长曲线,发现重组菌的生长比原始菌缓慢约2 h;通过测定荧光强度,发现sleB和cwlJ基因的敲除对菌株形成芽孢无影响;在LB固体培养基中,原始菌的芽孢萌发数为5.9×10⁸ CFU/mL,而重组菌芽孢未见萌发;在麦芽糖转化生成海藻糖体系中,原始菌株转化4h、8h、12h、16h后的芽孢萌发数均为5.8×10⁸ CFU/ml左右,而重组菌株芽孢在各个时间段均未萌发;通过添加不同物质刺激重组菌芽孢发现其对碳源、无机盐、氨基酸的刺激几乎无响应,对溶菌酶和表面活性剂的刺激有部分响应。