论文部分内容阅读
目的:通过实验验证补肾解毒通络方（BSJDTL）对白血病骨髓微环境的修复作用,并进一步探讨补肾解毒通络方修复后的骨髓微环境是否恢复对造血的支持功能,为白血病的治疗提供新思路。方法:通过建立白血病小鼠模型初步验证补肾解毒通络方在动物水平的作用,其次提取小鼠间充质干细胞培养,通过对间充质干细胞的细胞增殖等检测,以验证补肾解毒通络方对骨髓微环境的修复作用,后又通过对骨髓微环境中造血干细胞的活性等研究验证骨髓微环境的造血功能的修复,最后通过检测间充质干细胞对造血干细胞的细胞因子验证修复的骨髓微环境功能的恢复。研究一:选取健康BALB/C雄性小鼠48只,随机分为4组,正常对照组（Normal组）,模型对照组（Model组）,西药治疗组（CVPtern组）,补肾解毒通络组（BSJDTL组）,每组12只。通过γ射线照射和尾静脉注射L1210细胞系建立模型,通过评估小鼠的生长状况、骨髓涂片,检测外周血血常规及血清中CD4+、CD8+亚群水平,流式细胞术检测小鼠骨髓细胞中CD34+细胞和CD3-CD19+细胞的比例验证补肾解毒通络方对小鼠骨髓的修复作用。研究二:取研究一中小鼠的股骨骨髓细胞,采用全骨髓贴壁法选择培养间充质干细胞并用流式细胞术鉴定间充质干细胞表型,通过细胞集落实验检测间充质干细胞的增殖能力,流式细胞数检测间充质干细胞的周期、凋亡,CCK8法检测其细胞活性,q RT-PCR检测间充质干细胞增殖、分化及瘤化相关基因,验证补肾解毒通络方对骨髓微环境中核心细胞-间充质干细胞的修复作用。研究三:取研究一中小鼠的骨髓细胞,采用磁珠分选的方式提取造血干细胞培养,同时选择培养间充质干细胞,通过将间充质干细胞与造血干细胞共培养后检测造血干细胞的CCK8增殖活性、流式检测造血干细胞的凋亡,并对造血干细胞的集落进行检测,最后通过q RT-PCR检测造血干细胞的CDK1基因,验证补肾解毒通络方修复后的骨髓微环境对造血干细胞的支持作用。研究四:将研究二中共培养的间充质干细胞及造血干细胞分开收集,ELISA法检测二者共培养的细胞培养液上清,检测间充质干细胞分泌的细胞因子CXCL12、SCF及ICAM1,并通过q RT-PCR检测间充质干细胞分泌的细胞因子在基因水平的表达,证明补肾解毒通络方对修复的间充质干细胞的功能恢复,支持造血的作用机制。结果:研究一:补肾解毒通络方作用后的小鼠状态明显优于西药治疗组,外周血白细胞数较模型对照组及西药治疗组有所增高,外周血CD4+/CD8+比值有上升趋势,且骨髓细胞中CD34+细胞比例明显提高（P＜0.05）,而检测骨髓CD3-CD19+细胞比例结果也显示补肾解毒通络组小鼠其比例高于西药治疗组（P＜0.05）。研究二:补肾解毒通络方作用后的小鼠MSCs细胞克隆能力增强,细胞集落分析实验显示补肾解毒通络组的细胞聚落数较模型对照组及西药治疗组有明显增加（P＜0.05）。通过细胞周期检测实验也发现补肾解毒通络组的G0/G1期比例较模型对照组及西药治疗组显著降低,且S+G2期比例明显增高（P＜0.05）。细胞凋亡检测也表明补肾解毒通络组MSCs凋亡率最低。通过检测补肾解毒通络方作用后各组小鼠骨组MSCs表达的基因,各组CDK1基因表达未见明显差异。白血病小鼠模型对照组MSCs的CREB1及BIRC5基因表达明显增高,西药治疗组基因表达较模型对照组表达降低,而补肾解毒通络方作用后的MSCs明显降低了CREB1及BIRC5的表达（P＜0.05）。研究三:补肾解毒通络方作用后的MSCs共培养后的造血干细胞在BFU-E聚落数上有明显增多,且差异有统计学意义（P＜0.05）,在CFU-GM上也表现出聚落增多的趋势。通过CCK8实验对HSC的增殖能力进行检测,结果也表明在与补肾解毒通络方作用后的MSCs共培养后,造血干细胞的增殖能力较西药治疗组有明显提高（P＜0.05）,但检测细胞凋亡无统计学差异。q RT-PCR检测造血干细胞CDK1基因的表达显示模型对照组小鼠CDK1基因明显高于正常对照组,西药治疗组基因表达则较模型对照组增高,在与补肾解毒通络方作用后的MSCs共培养后,CDK1基因的表达被抑制（P＜0.05）。研究四:ELISA检测结果显示和正常对照组相比,模型对照组及西药治疗组分泌的CXCL12和SCF均有降低,但补肾解毒通络组有所回升,且对于CXCL12的分泌,较西药治疗组,补肾解毒通络方的升高更显著（P＜0.05）,对于ICAM1的分泌,相比于正常对照组,模型对照组及西药治疗组皆为上升趋势,但补肾解毒通络组为下降趋势,无统计学差异。对于q RT-PCR在基因水平的检测结果发现对于CXCL12及SCF的表达,各组细胞趋势一致,相比于正常对照组,模型对照组及西药治疗组均有下调,且对于CXCL12的分泌有明显统计学差异（P＜0.05）。和模型对照组相比,西药治疗组和补肾解毒通络组CXCL12的表达皆有上调,且补肾解毒通络组的上调更为明显,差异有统计学意义（P＜0.05）,和模型对照组相比,补肾解毒通络组SCF表达上调明显,且有统计学差异（P＜0.05）。和正常对照组相比,模型对照组和西药治疗组明显上调ICAM1的表达（P＜0.05）,而补肾解毒通络组的ICAM1的表达量则与正常对照组无明显差异,和模型对照组及西药治疗组有统计学差异（P＜0.05）。和模型对照组相比,西药治疗组分泌的ICAM1也有明显上调,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:实验通过对白血病小鼠模型的检测评估证明了补肾解毒通络方对小鼠骨髓的修复作用,进而通过间充质干细胞在补肾解毒通络方作用后细胞增殖能力增强、聚落数增多、细胞活性提高,增殖基因表达上调、分化基因、瘤化基因被抑制证明补肾解毒通络方对间充质干细胞的修复,同时对骨髓造血干细胞的检测结果也表明造血干细胞的增殖及自我更新能力的恢复,进一步说明骨髓微环境的修复,最后间充质干细胞高表达CXCL12、SCF,低表达ICAM1说明修复后的间充质干细胞对造血干细胞功能的恢复。