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目的:椎间盘退行性改变的分子生物学机制仍不明确,髓核细胞凋亡增加在椎间盘退变发生发展过程中发挥重要作用。TNF-a可以诱导髓核细胞凋亡,与椎间盘退变密切相关,外源性因素作用于细胞表达受体,内源性因素可能发挥调节作用,其中就包括microRNAs(miRNAs)。课题组前期研究发现椎间盘退变患者的髓核组织中存在异常表达的miRNAs,其中microRNA-494(miR-494)异常高表达,然而,miR-494在TNF-a诱导髓核细胞凋亡中的潜在作用机制仍然不明确。使用TNF-a刺激髓核细胞,建立髓核细胞凋亡模型;运用慢病毒包装miR-494转染髓核细胞,探究miR-494对TNF-a诱导髓核细胞凋亡的影响并探究其潜在作用机制,为椎间盘退变发病机制的研究奠定一定基础,开拓椎间盘退变基因诊断和生物治疗新视野。方法:收集脊柱爆裂骨折患者病例资料及术中摘除的髓核组织,根据患者术前影像学资料(X线,CT,MRI)进行TLISS评分系统和载荷分享评分系统评分,根据MRI进行Pfirrmann分级评价椎间盘退变程度。运用酶消化法进行髓核细胞原代培养,并鉴定获取的髓核细胞。分别使用不同浓度TNF-a(0ng/ml,10ng/ml,50ng/ml,100ng/ml)刺激髓核细胞,在0h,8h,16h,24h时间点,使用流式细胞术(Annexin V-PE/7-AAD)和实时荧光定量PCR检测髓核细胞凋亡率及mi R-494表达量。然后,将慢病毒包装的antigomiR-494感染髓核细胞,成功敲除髓核细胞内源性miR-494,转染后再加入TNF-a(100ng/ml,16h),流式细胞术检测细胞凋亡率和荧光定量PCR检测miR-494表达量。运用生物信息学方法、荧光素酶双报告基因分析技术及免疫蛋白印迹技术(Western-blotting)验证JunD是否是miR-494的靶基因之一。最后,Western-blotting检测细胞色素C表达水平。结果:髓核细胞凋亡率随TNF-a浓度和刺激时间的增加而增加(P<0.05),miR-494表达量亦是随TNF-a浓度和刺激时间的增加而增加(P<0.05),然而100ng/ml,16h组,髓核细胞凋亡率最合适,用于后续实验。细胞转染后,antigomiR-494+TNF-a组与对照病毒+TNF-a组相比,细胞凋亡率和miR-494表达量明显下降(P<0.05)。生物信息学方法预测、荧光素酶双报告基因验证证实miR-494直接靶向JunD基因。Western-blot结果显示antigomiR-494+TNF-a组JunD蛋白表达水平较对照病毒+TNF-a组高,且有统计学意义(P<0.05),进一步说明miR-494对JunD基因的靶向作用,antigomiR-494+TNF-a组细胞色素C蛋白表达水平较对照病毒+TNF-a组低,且有统计学意义(P<0.05)。结论:本研究证实TNF-a可以诱导髓核细胞凋亡,且呈剂量和时间依赖性。髓核细胞miR-494表达量随TNF-a刺激浓度、时间的增加而增加,miR-494可能是TNF-a诱导的髓核细胞凋亡的关键调节器,mi R-494敲除可以保护髓核细胞,其可能的机制是通过上调靶基因JunD并介导细胞色素C凋亡通路。miR-494-JunD-细胞色素C信号通路可能是椎间盘退变的潜在机制之一,其为未来椎间盘退变生物治疗及预防提供了靶点。