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血吸虫病是主要由血吸虫尾蚴感染宿主引起的一种重大的传染性寄生虫疾病,而其致病机制主要是虫卵沉积肝脏引起虫卵肉芽肿及继发肝纤维化,导致血吸虫性肝硬化。肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)作为肝脏的非实质细胞在肝纤维化形成过程中是主要的效应细胞,控制肝纤维化的方法之一为促进活化的HSCs发生凋亡,而线粒体依赖途径和死亡受体途径(Fas/FasL途径、TNFR途径、TRAIL途径)是目前发现的参与HSCs凋亡的重要途径。已有很多深入的研究涉及肝星状细胞增殖和活化的信号转导通路,而肝纤维化进展过程中HSCs凋亡发生及其相关信号通路的分子尚未阐明。课题组前期实验发现,ICOS转基因(ICOS-Tg)小鼠的肝纤维化水平以及HSCs活化水平显著高于野生型对照FVB-WT,本课题应用该小鼠血吸虫病实验模型,观察血吸虫病进展过程HSCs凋亡的表达动态,并探索共刺激ICOSL/ICOS信号在肝纤维化进展过程介导HSCs凋亡的机制以及对肝纤维化的影响及其分子机制,以深入探讨肝纤维化的病理机制以及寻找利用细胞凋亡逆转肝纤维化的新途径。一、日本血吸虫感染小鼠慢性致病过程中原代HSCs凋亡及其相关信号通路分子表达动态目的:探讨日本血吸虫肝纤维化疾病模型HSCs凋亡及其相关信号通路分子的表达动态。方法:1、显微镜下计数5♂+7-10♀条血吸虫尾蚴贴于剪毛的小鼠腹部,感染15min建立疾病模型,收集固定感染前(0周)、感染急性病变期(6周、9周)、感染慢性期(12周)、感染晚期(16周)的小鼠肝组织,应用HE染色方法观察肝脏切片中虫卵肉芽肿的面积变化。2、通过原位肝脏门静脉胶原酶灌注消化肝脏,研磨后梯度离心提取HSCs。提取周期分别为感染前(0周)、感染急性病变期(6周、9周)、感染慢性期(12周),应用荧光显微镜及细胞免疫荧光方法鉴定。3、应用TUNEL方法检测肝脏切片中HSCs凋亡情况。小鼠原代HSCs用Annexin V-FITC/PI双染孵育,然后用流式检测凋亡率。应用实时荧光定量PCR(Real time fluorescence quantitative PCR,Real-time PCR)技术检测培养 7 天后原代HSCs中与凋亡相关分子基因的表达,并用分析其在血吸虫尾蚴慢性致病过程中的动态变化。结果:1、HE染色结果显示:感染前(0周)肝小叶结构完整,无纤维化产生,肝细胞形态完好,未有炎性浸润,而感染后可见,小叶结构被破坏,可见虫卵肉芽肿沉积,急性期肉芽肿面积达到最大[6周(7.14±0.74)×104μm2,(P<0.0001)],炎性细胞浸润在肉芽肿周围,胶原纤维沉积,随着感染时间增加,肉芽肿面积缓慢下降[9周(5.58±0.77)×104μm2(P<0.001),12周(4.78±0.45)×104μm2(P<0.01),16周(4.31±0.42)×104μm2],胶原沉积逐渐增加。2.、分离原代HSCs,新鲜分离的细胞呈圆形,由于内储存有维生素A脂滴具有折光性,并且脂滴在328nm的紫外激发光下能够观察到蓝绿色荧光,GFAP细胞免疫荧光染色培养3天的细胞,荧光显微镜下细胞浆中可以观察到红色荧光,提取的细胞纯度为90%以上。3、TUNEL结果显示,肝脏虫卵肉芽肿周围凋亡的HSCs自感染后升高,6周后到达峰值(19.5±2.53,P<0.0001),9周、12周下降但仍处于较高水平[9周(10.7±0.895),P<0.01,12 周(9.3±0.7895),16 周(9.2±1.041)]。流式细胞术结果显示,原代HSCs的凋亡率自感染6周[(45.19±0.7463)%,P<0.0001]后到达峰值,随后逐渐下降9周[(31.93±2.292)%,P<0.01],在慢性期(12周)开始下降至较低水平[(13.61±1.407)%,P<0.01]但仍高于正常水平(5.907±0.8856)%。Real-time PCR结果显示,死亡受体信号通路中Dr5及其配体Trail的表达均在6周达到最高,9 周、12 周下调:[Trail6 周(7.7±1.3,gene/GAPDH),P<0.05,9 周(1.5±0.2,gene/GAPDH),P<0.05,Dr5 6 周(2.29±0.09,gene/GAPDH),P<0.01、9 周(2.015±0.065,gene/GAPDH)、12 周(1.055 ± 0.005,gene/GAPDH,P<0.01)],Fas的表达在感染后处于升高趋势,但无统计学差异。FasL表达在感染后持续增加,并且在9周达到最高(2.873±0.5113,gene/GAPDH)然后开始下降[12周(1.04±0.01528,gene/GAPDH),P<0.05]。线粒体信号通路中促凋亡基因Bax表达量感染后6周最高,然后表达量降低,抗凋亡基因Bcl-2呈现相同的变化趋势:Bax 6 周(2.247±0.3047,gene/GAPDH),P<0.05]、9 周(1.43±0.1572,gene/GAPDH)、12 周(1.31±0.07371,gene/GAPDH),Bcl-2 6 周显著升高[(9.023±0.7823,gene/GAPDH),P<0.0001]、9 周降低[(3.253±0.508,gene/GAPDH),P<0.01]、12 周持续降低[(1.553±0.1713,gene/GAPDH),P<0.05]。结论:日本血吸虫慢性致病过程中HSCs的凋亡在感染急性病变期到达峰值,在慢性期(12周)开始下降至较低水平,但仍高于正常水平。与HSCs活化增殖相关分子的表达变化趋势相同。线粒体凋亡信号通路中促凋亡基因Bax与抗凋亡基因Bcl-2表达量感染后6周最高,与HSCs凋亡关系更为密切。二、共刺激信号ICOSL/ICOS对HSCs凋亡及其相关信号通路分子表达动态的影响目的:探讨上调ICOSL/ICOS对于血吸虫肝纤维化疾病模型HSCs凋亡的调控作用。方法:1、收集固定感染前,感染后6周、9周、12周肝组织应用HE染色的方法观察ICOS-Tg小鼠与WT小鼠肝组织病理变化。2、应用TUNEL检测ICOS-Tg小鼠与WT小鼠肝脏切片中HSCs凋亡情况。应用Annexin V-FITC/PI双染法检测分离ICOS-Tg小鼠与WT小鼠的原代HSCs凋亡情况。应用实时荧光定量PCR扩增方法检测ICOS-Tg小鼠与WT小鼠原代HSCs中与凋亡相关信号通路分子基因的表达水平,分析相关基因在血吸虫致病过程中的动态表达。结果:1.、组织切片HE染色可见感染后ICOS-Tg小鼠肝脏虫卵肉芽肿面积较WT 小鼠高[6 周:(10.44±1.30)×104μm2 vs(7.14±0.74)×104μm2,P<0.5]。2.、TUNEL结果分析发现,日本血吸虫感染后小鼠肝脏虫卵肉芽肿周围凋亡的 HSCs ICOS-Tg 较 WT 型高[6 周 38±3.486 vs 19.5±2.535,P<0.0001;9 周15.6±1.024vs10.7±0.895,P<0.05],并具有统计学差异。流式细胞术检测ICOS-Tg原代HSCs凋亡率较同期 WT高[6周(57.76±3.707)%vs(45.19±0.7463)%,P<0.01、9 周(44.43±2.328)%vs(31.93±2.292)%,P<0.01]。实时荧光定量 PCR 检测表明,ICOS-Tg与WT小鼠在感染日本血吸虫后凋亡相关基因总体变化趋势一致,但 ICOS-Tg 均高于同期 WT 基因表达水平[Trail:6 周,(24.59±0.34)vs(7.7±1.3),P<0.0001;9 周,(7.775±0.565)vs(1.5±0.2),P<0.0001];[dr5:0 周,(2.275±0.025)vs(1±0),P<0.01;6 周,(4.7±0.47)vs(2.29±0.09),P<0.0001;9 周(4.725±0.165)vs(2.015±0.065),P<0.0001;12 周,(2.355±0.125)vs(1.055±0.005),P<0.01];[Fas:12 周,(3.03±0.46)vs(1.735±0.323),P<0.05];[FasL:6 周,(3.543±0.5368)vs(1.593±0.3185),P<0.01];[Bax:9 周,(2.463±0.006667)vs(1.43±0.1572),P<0.01];[Bcl-2:6周,(6.06±0.4499)vs(9.023±0.7823),P<0.001];[Caspase-3:6 周,(2.923±0.1868)vs(1.627±0.07688),P<0.0001;12 周,(1.65±0.1501)vs(1.163±0.06333),P<0.05]。结论:共刺激信号ICOSL/ICOS的上调,使得ICOS-Tg小鼠肝脏虫卵肉芽肿面积较WT增加。上调共刺激信号ICOSL/ICOS,也增加了 HSCs的凋亡,凋亡相关信号通路分子的表达也较同期WT表达水平高。ICOSL/ICOS上调后,HSCs的凋亡与HSCs的激活都较WT增加,而HSCs凋亡是缓解肝纤维化的手段,ICOS-Tg小鼠肝组织纤维化程度表现为加重推测可能机制为HSCs被激活细胞数高于凋亡率的增加,最终表现为纤维化程度加重。感染后期虽然HSCs的凋亡率与HSCs被激活率均下降,但HSCs被激活率依然高于凋亡率使得肝组织纤维化程度加重。三、共刺激信号ICOSL/ICOS调控HSCs凋亡介导日本血吸虫感染小鼠肝纤维化分子机制的初步探讨目的:初步探讨共刺激信号ICOSL/ICOS在日本血吸虫感染小鼠病程中调控HSCs凋亡的分子机制方法:用TGF-β与IL-13重组蛋白刺激HSCs细胞系JS1,收集细胞后用Annexin V-FITC/PI孵育后并用流式刺激前后细胞凋亡情况,应用Giemsa染色细胞爬片观察正常细胞与典型凋亡细胞在镜下的形态并比较不同之处。结果:流式结果显示,TGF-β重组蛋白作用于HSCs细胞系JS1后,细胞凋亡率较对照组增加[5ng/ml:control 组(13.38±0.135)vs TGF-β 组(20.02±1.4),P<0.5;10ng/ml:control 组(13.38±0.135)vs TGF-β 组(21.65±2.235),P<0.5],具有统计学意义。IL-13刺激后,凋亡率增加但无统计学意义。Giemsa染色结果显示,正常细胞细胞核呈深蓝色,凋亡细胞核深染,细胞质浓缩,可见凋亡小体。结论:课题组前期研究表明在ICOS-Tg小鼠疾病模型中上调ICOSL/ICOS信号过表达Th2型细胞因子TGF-β,能够促进细胞凋亡,这可能为ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫疾病进程中凋亡率高于WT型小鼠的原因。本研究结果表明,ICOSL/ICOS信号在调控小鼠肝纤维化进展中可影响HSCs凋亡,其分子机制可能为上调共刺激ICOSL/ICOS信号过表达Th2型细胞因子TGF-β。