论文部分内容阅读
研究背景:特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种常见的病因不明、呈进行性、不可逆性、致死性高的间质性肺泡炎,以炎症细胞渗出和浸润、上皮细胞损伤及基底膜脱落、成纤维细胞及肌成纤维细胞增殖、细胞外基质过度堆积、最终呈弥漫性纤维化为基本病理改变的疾病。目前临床缺乏有效的治疗方法,积极进行IPF发病机制及治疗的研究,具有重要的理论和实际意义。鉴于干细胞调节免疫、抗炎、抗纤维化的作用,近年来,人们积极探索了胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、骨髓间充质干细胞、脐血(带)间充质干细胞等治疗IPF的可能性,取得了较为理想的效果,但存在安全性、伦理、取材困难等问题,寻找新的干细胞来源,是目前干细胞治疗IPF的迫切任务。脂肪间充质干细胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)具有来源丰富、取材方便、创伤小、病人依从性好、特别是细胞活性受年龄的影响较小等优点,应是治疗IPF的理想细胞,但目前尚未见ADSCs用于治疗肺纤维化的报道。有鉴于此,本课题通过ADSCs治疗IPF作用及机制的研究,探讨了ADSCs治疗肺纤维化的可能性,为临床开展ADSCs治疗IPF提供实验依据。一.小鼠脂肪间充质干细胞的分离、培养、扩增和鉴定目的:分离、培养、鉴定雄性C57BL/6实验小鼠的脂肪间充质干细胞,获得活性好、纯度高的脂肪间充质干细胞。方法:取4只6-8周龄正常雄性小鼠,在无菌条件下分离双侧下肢腹股沟皮下和附睾处脂肪组织并将脂肪组织剪碎,使用脂肪组织消化液处理并收集细胞。加入(低糖,含10%胎牛血清)DMEM培养基,吹打成单细胞悬液,接种于6孔细胞培养板上,37℃、5%二氧化碳细胞培养箱中培养。按照l:3比例进行传代。倒置相差显微镜下观察细胞形态学特点;流式细胞仪检测细胞表面CD29、CD44标记和免疫荧光检测证实细胞表面CD29、CD44标记;在体外定向诱导MSCs向脂肪细胞分化;通过油红O脂类染色法检测其成脂肪能力。结果:原代培养的小鼠ADSCs细胞为贴壁生长,呈梭形或纤维型,初代细胞增殖能力强,扩增速度快,贴壁培养4天后,达到80%融合。传代后细胞增殖能力有所下降,细胞形态和初代没有区别。经免疫荧光检测证实有细胞表面标志蛋白CD29、CD44标记;经流式检测细胞表面CD29表达为98.9%,细胞表面CD44表达为75.6%。油红O脂类染色法检测证明MSCs具有向脂肪细胞分化的能力。结论:低浓度胶原酶1次消化、孵育、多次收集与差速贴壁法,获得的ADSCs具有间充质干细胞的形态和细胞表型特点,性状稳定、活性好、纯度高、具有分化潜能。二.ADSCs移植治疗小鼠博来霉素性IPF的效果及机制目的:研究移植小鼠ADSCs治疗肺纤维化的效果,探讨其治疗机制。方法:取雌性实验小鼠60只,随机分为4组,每组15只。第1组(A组)为对照组;第2至4组经气管内注入2.5mg/kg体重博来霉素0.3m L;2周后,达到肺纤维化模型标准。第2组(B组)为模型阳性对照组,造模后未予任何处理;第3组(C组)予尾静脉注射250μLPBS溶液;第4组(D组)予尾静脉注射250μLPBS稀释的ADSCs细胞(细胞数1.0*106个)。实验第28天,尾缘静脉取血,处死所有实验组小鼠,立即开胸分离完整的肺组织,分为两份,其中一份清洗后放入10%甲醛溶液中固定24小时;另一份肺组织取肺泡灌洗液后直接冻存。观察各组肺纤维化HE染色病理学改变;测定各组细胞凋亡情况;测定羟脯氨酸含量;ELISA检测灌洗液炎症因子IL-1、PDGF、TNF-α表达水平。结果:与A组(正常对照组)相比,病理显示B组和C组有严重的肺纤维化,D组(IPF+ADSCs组)胶原纤维化程度明显下降,表明移植ADSCs能有效减轻肺纤维化。TUNEL实验显示:D组(IPF+ADSCs组)凋亡细胞百分比高于A组(正常对照组)(P<0.05),但低于B组(IPF组)及C组(IPF+PBS组)(P<0.05)。表明移植ADSCs后凋亡细胞明显减少。羟脯氨酸(HYP)含量结果显示:D组(HYP)含量64.10±1.25μg高于A组(P<0.05),但低于B组及C组(P<0.05);说明移植ADSCs可减轻肺纤维化。在灌洗液细胞炎症因子中,ELISA检测结果:D组IL-1的含量181.97±8.42 pg/ml,高于A组(P<0.05),但低于B组及C组(P<0.05);D组PDGF的含量115.58±6.88 pg/ml,高于A组(P<0.05),但低于B组及C组(P<0.05);D组TNF-α的含量30.19±3.51 pg/ml,高于A组(P<0.05),但低于B组及C组(P<0.05);移植ADSCs后炎症因子表达降低。结论:ADSCs治疗,可以明显减轻IPF肺组织的炎症反应、细胞凋亡、肺泡间质增生和纤维化程度。ADSCs治疗IPF,可能通过调节宿主病变部位免疫反应、抑制炎症、抑制纤维化、和减少肺泡上皮细胞损伤而实现的。