早在上世纪六十年代，美国学者Leonard Hayflick发现哺乳动物来源的细胞在体外培养的过程中其分裂的次数是有限的，并且细胞在体外可传代的次数与其寿命有关，并由此提出“Hayflick界限”理论。对多细胞有机体来说，衰老是组织内的稳态以及器官功能逐步丧失的过程，成体干细胞广泛的分布在身体各处，为机体的自我更新和组织修复提供细胞来源，因此人体内自我更新的干细胞有限的分裂能力可能是引发整个机体衰老的重要原因。近些年，间充质干细胞（Mesenchymal stemcells, MSCs)作为一种重要的成体干细胞受到了越来越多的关注。由于其取材方便、易于分离培养，低免疫原性，具有多向分化潜能等诸多的优点，已经成为了在细胞治疗和基因治疗等领域较为理想的种子细胞。然而，由于MSCs在体内所占比例较低，在临床应用之前需要进行大规模的扩增培养以此来获得足够数量的细胞。但是，MSCs在体外经过长期培养容易衰老，其形态和生理机能会发生较大改变。例如：增殖减慢，生长停滞；干性减退，丧失分化能力；甚至具有致瘤性，这些经过长时间培养的MSCs已经不再适用于临床应用。因此研究MSCs的衰老不仅仅可以使我们多角度的来认识机体发生衰老的机制，同时还可以为以后的临床治疗提供更优质的细胞来源。基于这种目的，我们设计了这个课题，希望在探索MSCs衰老分子机制的同时能够找出一种可以延长MSCs寿命的新方法。近些年来，很多研究团队都关注到了沉默信息调节蛋白2（silent information regulator2，SIR2）在调节低等生物抵抗不良环境以及延长其生存周期等过程中所发挥的重要作用。同样，在哺乳动物体内存在的蛋白去乙酰化酶SIRT1与SIR2高度同源，越来越多的研究也表明SIRT1可以通过调控P53，Ku70，FOXO，E2F1，NF-κB，和PGC-1α等关键分子的表达，进而参与调控细胞的衰老、凋亡、代谢等生理活动。为了研究SIRT1在MSCs衰老中的作用，我们通过慢病毒稳定转染体系将SIRT1的干涉表达和过表达载体分别导入到MSCs中，同时结合细胞增殖和衰老等相关指标的检测，来研究SIRT1对MSCs增殖和衰老的影响。首先在研究当中，我们观察到骨髓和脂肪来源的MSCs在体外经过长时间培养之后，出现生长停滞、细胞形态变大扁平等衰老特征，衰老相关半乳糖苷酶染色（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal）表明随着细胞不断的传代，衰老细胞的比例逐渐增多，SIRT1蛋白水平的表达会随着细胞不断的传代而显著的下降。虽然不同组织来源、不同个体来源的SIRT1的下调水平略有不同，但是整体趋势是一致的。这就提示我们，SIRT1在MSCs衰老的进程当中可能会发挥着重要的作用。因此，我们先通过抑制SIRT1的表达来研究SIRT1与衰老发生之间的关系。在研究当中，我们利用慢病毒转染体系结合RNA干涉技术，在早期骨髓和脂肪来源的MSCs中成功地下调SIRT1的表达（干涉效率﹥90%）。为排除ShRNA潜在的脱靶效应，我们选择了两套针对SIRT1序列不同位点的ShRNA。通过BrdU掺入实验和PI染色实验可以发现，在下调表达SIRT1的骨髓和脂肪来源的MSCs中，处于增殖期的细胞数目分别为对照组的32%和45%，生长曲线也表明细胞增殖显著减慢。通过SA-β-gal衰老特异染色我们发现，在长时间的培养过程中，SIRT1的下调表达会明显的促进细胞的衰老，衰老细胞的数目在两种不同类型的MSCs中分别增加5.5倍和4.7倍。上述结果表明抑制SIRT1的表达会降低MSCs的增殖，加速细胞的衰老，SIRT1在维持MSCs未衰老状态中发挥着不可或缺的作用。接下来我们从反面验证，SIRT1的过表达是不是可以促进MSCs的增殖或者延缓MSCs的衰老甚至是逆转衰老的细胞。同样，我们利用慢病毒转染体系，在骨髓来源的MSCs当中成功过表达SIRT1以及无酶活性的负显性突变体SIRT1-H363Y，我们发现突变载体H363Y的作用与下调SIRT1表达的效果类似。在转染早期，细胞增殖减慢，处于增殖期细胞数目减少5.9倍，衰老细胞数目增加4.9倍。而在此时，是否过表达SIRT1对细胞的增殖与衰老影响不大，然而随着转染细胞不断的传代，过表达SIRT1的MSCs与对照组相比，处于增殖期的细胞数目是对照组的2.7倍，衰老的细胞数目却只有对照组的56%，细胞增殖期延长30天左右才会进入到平台期。但是，SIRT1过表达的MSCs最终还是会出现生长停滞的现象，进入衰老期。因此，我们可以得出结论，通过体外过表达SIRT1可以延缓细胞的衰老，但是不能终止衰老的进程。虽然，在MSCs中过表达SIRT1可以延缓细胞衰老，但是对于以后可能的临床应用，我们还要保证SIRT1过表达修饰过的MSCs仍然具有干细胞的分化潜能。我们通过流式检测了MSCs相关的表面标志如CD31、CD34、CD90和CD105的表达，以及其成脂与成骨的分化潜能。结果表明：SIRT1过表达不会导致MSCs的分化，基因修饰之后的MSCs仍然具有分化潜能，这也从另外一个角度说明了SIRT1对MSCs增殖的影响与其分化能力的改变无关。为了进一步探索SIRT1调控MSCs衰老的机制，我们着重检测了衰老相关信号通路当中的两个关键分子P21Cip1与P16INK4a的表达变化情况。我们发现：SIRT1下调之后引起骨髓来源MSCs的衰老，P16INK4a的表达明显升高，P21Cip1的变化并不显著；对于脂肪来源的MSCs来说，P21Cip1与P16INK4a的表达却均有升高。在长时间培养的过程中，SIRT1的过表达可以减缓P16INK4a的积累，但对P21Cip1表达的影响不大。这些结果表明，SIRT1影响骨髓来源的MSCs的衰老主要是通过P16INK4a信号通路并不是P21Cip1通路，同时可以看出衰老发生的机制在不同组织来源的MSCs当中略有不同。上述结果可以明确证实SIRT1可以通过调控P16INK4a的表达来影响MSCs的增殖与衰老。为了更好的应用于临床，我们考虑是否能够将以激活SIRT1为靶点的小分子作为激动剂加入到MSCs的培养体系当中。从葡萄皮当中提取的天然化合物白藜芦醇，被很多人当作SIRT1的天然激活剂，但是它的作用却很有争议。因此，我们在课题当中检测不同浓度的白藜芦醇以及不同的作用时间能否促进MSCs增殖和延缓细胞衰老。我们发现5μM和20μM的白藜芦醇作用两天，可以促进MSCs增殖，但是上述浓度的白藜芦醇持续长时间作用反而加速了MSCs的死亡，这表明高浓度的白藜芦醇具有毒性。由此可见，白藜芦醇只能瞬时的促进MSCs的增殖。综上所述，我们的课题研究不仅可以使我们很好地理解SIRT1在MSCs衰老过程中的作用，还有利于进一步分析SIRT1在MSCs衰老过程中的机制，同时还提供了一个可以延缓间充质干细胞衰老的新策略。药物、酒精等因素引起的终末期肝病是困扰人类健康的一类顽疾。目前，肝细胞移植、生物人工肝以及组织工程化肝脏等治疗方法的研究为终末期肝病的治疗带来新的希望。但令人遗憾的是，肝细胞来源受限、数量不足以及功能欠缺等因素制约了其进一步应用。胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESCs）具有分化的全能性以及高度自我更新能力，成为较为理想的种子细胞。各国科研人员通过模拟肝脏在体内的发育环境采用分步诱导的方式，使ESCs依次经定型内胚层阶段、肝干细胞阶段、肝祖细胞阶段、最终分化为肝细胞。通过近几年不断的优化诱导条件，人们可以将胚胎干细胞向定型内胚层（流式检测CXCR4+和SOX17+双阳性）的效率提高到90%以上，进一步诱导为肝干/祖细胞阶段，其标志性蛋白AFP的阳性率也在93%，即使最终肝细胞特异标志蛋白ALB和α1-AT的阳性率也在90%以上，但是成熟肝细胞的标志ASGPR最高也只在60%左右，同时所获得肝细胞在生物功能上与正常肝细胞仍有很大的差别。而获得成熟有功能的肝细胞无论对终末期肝病的治疗还是对药物筛选平台的建立都有重要意义。因此，我们将重点关注胚胎干细胞向肝细胞分化过程中肝干/祖细胞向肝细胞的分化这一阶段，此阶段是得到有功能的成熟肝细胞的关键。肝脏是一个复杂的异质性器官，其中肝实质细胞和非实质细胞有序稳定的排列，保证了细胞与细胞之间相互通讯，继而保障肝脏发挥正常的功能。不同类型的细胞连接决定了细胞与细胞之间有序的排列。因此我们考虑是否能够通过增强细胞之间的连接来促进细胞之间的有序排列从而促进肝前体细胞进一步发育，最终得到功能稳定的成熟的肝细胞。肝组织内各细胞之间存在大量的紧密连接、缝隙连接、桥粒及半桥粒等不同类型的连接。其中缝隙连接不仅是细胞与细胞之间物质运输的通道，还可以和很多蛋白偶联，受它们的调控或借助它们调控下游的分子从而发挥更大的功能。缝隙连接蛋白Connexin32和Connexin43（CX32/CX43）是肝脏中最重要的两类缝隙连接蛋白。我们发现二者的表达在肝干细胞向肝细胞转变过程中出现同步相反的变化，即在肝祖细胞阶段CX32低表达而CX43高表达，随着向肝细胞的分化CX43表达降低CX32表达则会升高。这一现象提示二者表达变化可能在肝干细胞向肝细胞分化及成熟过程中发挥重要作用，同时CX32/CX43的这种同步上调与下调表达又有可能受到什么关键分子的调控？在本部分实验中，我们开展了缝隙连结蛋白CX32/CX43在肝干/祖细胞向肝细胞分化中的作用及其机制研究。希望从细胞与细胞之间相互作用的角度来寻找肝细胞分化成熟的新机制，同时探索其中可能的分子机制，最终目的在于引入新策略进一步优化胚胎干细胞向肝细胞的诱导分化体系。我们使用目前较为公认的肝干/祖细胞系（WB-F344）作为研究对象，该细胞系易于在体外培养和进行基因操作，且具备向胆管上皮细胞以及肝细胞的双向分化潜能，其所处的发育阶段与我们要重点关注的胚胎干细胞向肝细胞分化的过程中的肝祖细胞阶段类似。我们对WB-F344进行双向的诱导分化，通过Realtime PCR和Western blot、免疫荧光检测相关基因和蛋白的表达，我们发现WB-F344向肝细胞分化中存在CX43表达下调、CX32上调的规律，而向胆管分化过程中则呈现出相反的变化，这与CX43和CX32在体内的分布具有一致性，即CX32仅高表达在肝细胞膜表面，CX43在胆管附近有干性的细胞中高表达。为了能够更好的研究CX43和CX32表达变化与肝向分化之间的关系，我们构建了CX32和CX43慢病毒表达载体和CX43干涉表达载体，并分别建立起稳定转染上述载体的WB细胞系。将其放在向肝细胞分化的条件下诱导，结果表明：CX32过表达以及CX43下调表达对于肝干/祖细胞向肝细胞的分化都有很好的促进作用。接下来，我们考虑既然CX32/CX43在肝干/祖细胞向肝细胞分化成熟的过程中所表现出来这种同步逆向的表达变化会显著促进肝细胞的分化，那么有没有可能CX32/CX43共同接受同一关键分子的调控，才使得它们上调与下调表达同步进行？我们发现p38MAPK在肝干/祖细胞向肝细胞分化成熟的过程中是一个去磷酸化的过程，同时在大鼠的肝脏当中，我们发现磷酸化的p38MAPK更多的表达在汇管区，也就是肝前体细胞富集的区域，提示抑制p38MAPK磷酸化水平有利于肝干/祖细胞向肝细胞分化。我们通过体内试验证实，p38MAPK的小分子抑制剂可以调控CX43和CX32的表达。我们将p38MAPK的小分子抑制剂加入到肝干/祖细胞向肝细胞诱导分化体系当中，p38MAPK的小分子抑制剂可以明显的抑制CX43的表达，促进CX32的表达，从而促进肝干细胞向肝细胞的分化。然而CX43的过表达会减弱p38MAPK的小分子抑制剂的作用。除此之外，我们还利用体外分离纯化的原代大鼠的肝干细胞，进一步验证了p38MAPK的小分子抑制剂对CX32/CX43的表达调控作用，也得到了较一致的结论。在前面的工作当中，我们的实验结果可以很好的证实无论是在WB-F344细胞系还是在体外分离的大鼠原代肝干细胞向肝细胞分化过程中，p38MAPK均可以通过调控细胞连接蛋白的表达来促进肝干/祖细胞向肝细胞的分化。因此，我们将p38MAPK的抑制剂用于人胚胎干细胞向肝细胞的诱导分化过程中肝干/祖细胞阶段向成熟肝细胞的阶段。实验结果初步表明p38MAPK的抑制剂对CX43的抑制作用更为明显，也能够更好的促进CYP1B1的表达。综上所述：p38MAPK的小分子抑制剂可以抑制p38MAPK的磷酸化，从而促进CX32的表达，抑制CX43的表达，最终可以促进肝细胞特异的ALB和CYP1B1的表达。为我们以后进一步开展p38MAPK的小分子抑制剂对人胚胎干细胞向肝细胞诱导分化的研究奠定坚实的基础。